Bu yöntem beyin yapılarında astrositik ağların organizasyonu ile ilgili anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, etiket hücrelerini saymak ve tanımlanmış bir yapı içinde anatomik organizasyonlarını belgelemek için tarafsız bir yöntem önermesidir. ImageJFIJI'yi açın, istediğiniz dosyayı seçin ve biyo biçimin alma seçenekleri penceresinde Tamam'ı tıklatın.
Yalnızca son Z yığını için gereken optik dilimleri içeren bir Z yığınını yeniden tanımlamak için önce STK ve Z projesini seçin ve ardından araç çubuğundaki yığın düğmesini tıklatın. Projeksiyon türü ayarında maksimum yoğunluğu seçin. Dosyayı kaydedin ve yığın dosyasını adlandırın.
Görüntüleme dosyası birden fazla kanal içeriyorsa, yalnızca astrositik ağın görüntüsünü içeren kanalı göstermek için görüntü rengini ve kanalları bölmeyi kullanın. Görüntü, özellikler, piksel, piksel boyutu için bir seçerek görüntünün piksel ayarlarını kontrol edin. Daha sonra açma işlemini ve arka plan biyocytin etiketleme kaldırmak için arka plan çıkararak arka plan aracını kullanın.
Genellikle 50 piksel olarak ayarlanmış yuvarlanan top yarıçapını ayarlamak için önizleme işlevini kullanın. Arka plan adımını çıkarma işleminden sonra daha fazla gürültü azaltma gerekiyorsa, işlem, gürültü seçin ve aykırılıkları kaldırın. Hangi aykırı ayarlarda parlak'ı seçin ve yarıçapı ve eşiği ayarlamak için önizleme işlevini kullanın.
Burada gösterildiği gibi verileri bulanıklaştırabileceğinden, dış layıcı yıkıntıcıyı kullanırken dikkatli olun. Görüntüyü kullanarak eşiği ayarlayın, ayarlayın, eşiği ayarlayın. Varsayılan ve B ve W modunu seçin.
Apply'a tıklayın. İşlem, ikili ve ikili yapma işlemini seçerek görüntüyü ikili işlem aracıyla ikili bir görüntüye dönüştürün. Dosyayı bir tiff dosyası olarak kaydedin ve ikili dosya olarak adlandırın.
Hücreleri saymak için önce analiz et ve ölçümü ayarla'yı tıklatarak ölçüm türünü ayarlayın. Sonra santrifüj seçeneğini seçin. İkili dosyanın ekranda açık olduğundan emin olun.
Yine, çözümleme menüsünü açın ve bu kez parçacıkları analiz seçin. Ardından, göster ve anahatları seçin. Bu, algılama sonucunu gösteren yeni bir dosya oluşturur.
Algılamayı hassaslaştırmak için parametreleri optimize edin. Yalnızca hücreleri algılamak için, 30 ile 6000 arasında bir boyut değeri ve mükemmel bir daireyi ve rasgele bir şekli sıfırla sıfırarasında bir ebat değeri kullanın. Tamam'ı tıklatarak algılamayı çalıştırın. İki tablo, algılanan hücre sayısını sağlayan özet başlıklı bir tablo ve her hücrenin X ve Y koordinatlarını sağlayan sonuçlar başlıklı bir tablo görüntülenir.
Değerleri kopyalayın ve elektronik tablo uygulamasına yapıştırın. Bu tabloyu ad algılama tablosunun altına kaydedin. Algılanan hücrelerin çizimine sahip bir dosya da görünür.
Bu dosyayı ad algılama dosyasının altında tiff dosyası olarak kaydedin. İki veya daha fazla etiketli hücreden oluşan bir grup, analiz parçacıkları aracıyla tek bir hücre olarak algılanırsa, analiz parçacıkları aracını uygulamadan önce işlem, ikili ve havza seçerek ikili görüntüdeki havza aracını kullanın. Ağların yüzey alanını ölçmek için ImageJ'deki algılama dosyasını kullanın.
Araç çubuğundaki çokgen seçim aracını seçmek için fareyi sol tıklatın. İlgi çekici bir bölgeyi veya ağın dış çevresinde bulunan tüm hücreleri bağlayan YG'yi izlemek için yeniden sol tıklatın. Çokgeni kapatmak için sağ tıklatın.
Ayarlı ölçüm penceresini açın ve alan seçeneğini seçin. Ardından YG yöneticisini açın ve ekle'yi tıklatarak yG yöneticisine izlenen çokgeni ekleyin. YG yöneticisinde ölçüyü tıklatarak ölçümü çalıştırın.
Alan ölçümü bir tabloda görünür ve piksel cinsinden ifade edilir. Bu değeri, değerin metrekare olarak elde edilmesinde kullanılan mikroskop için bir dönüştürme faktörü ile dönüştürmeyi unutmayın. Stack dosyasını ImageJFIJI'de açın ve yamalı hücreyi daha güçlü etiketleme yoğunluğuyla tanımlayın.
Ardından, elektronik tablo uygulamasında algılama tablosu adlı dosyayı açın ve yamalı hücre ve ilgili koordinatlarıyla ilişkili sayıyı bulun. Yamalı hücreyi doğru bir şekilde belirleyemiyorsanız, biyositin birikiminin yoğun olduğu alanı çevreleyen çokgen aracını kullanın ve bu konuma yamalı hücreninki olarak bakın. YG yöneticisini, yamalı hücre konumundan bir yG çizmek ve ygyöneticisine eklemek için daha önce olduğu gibi kullanın.
Ardından, ölçümü ayarlayın ve merkezci seçeneği seçin. RIO yöneticisiolarak, izlenen alanın centroid koordinatlarını elde etmek için ölçmek tıklayın. Bu koordinatları bu özel ağ için başvuru noktası olarak kullanın.
Yamalı astrosite atıfta bulunarak her hücrenin koordinatlarını hesaplamak için bu formülü kullanın. Yamalı astrosite atıfta bulunarak her hücrenin koordinatlarını ifade etmek, yamalı astrositlerden vektörü hesaplamak için önemli bir adımdır. Tercihli yönelimin ana vektörünün koordinatlarını hesaplamak için bu formülü kullanın.
Ağın tercihli yöneliminin ana vektörü, ağda oluşan her hücre için önceden hesaplanan tüm vektörlerin toplamıdır. Değerleri normalleştirmek ve ağlar arasında karşılaştırmaları etkinleştirmek için, yamalı hücreyi dışlamak için ana vektörün uzunluğunu ağdaki hücre sayısına bölün. Her ağın ilgi çekirdeğindeki konumunu belirlemek için, önce dört x görüntüyü bir vektör görüntü düzenleyicisi ile açın.
Dört x görüntünün boyutunu artırmak için boyut penceresindeki boyutları beşle çarpın. Burada, görüntü 800 ile 800 piksel olarak örneklendi ve böylece örnekleme çözünürlüğü 4000'e 4000 piksel olarak değiştirildi. Dosyayı tiff biçiminde dışa aktarın ve dört x yeniden boyutlandırın.
Yeniden boyutlandırılmış dört x görüntünün sol üst köşesini Adobe Illustrator belgesinin sol alt köşesiyle hizalayın. Yazılım sol alt köşe referans noktasından koordinatları sağlar. Ağın 20 x görüntüsünü açın.
İkili dosyayı veya algılama dosyasını kullanın, çünkü hizalamaları daha kolaydır. Daha sonra, 20 x görüntünün ikili dosyasındaki opaklık aracıyla oynayArak yeniden boyutlandırılmış dört x görüntüyle hizalayın. Hizalama yapıldığında, pipet aracını seçin ve basılı tutun, böylece ölçü aracı görünür ve sol araç çubuğunda seçin.
20 x'lik görüntünün sol üst köşesine tıklayarak 20 x referans noktasının koordinatlarını yeniden boyutlandırılmış dört x görüntüye ulaşmak için ölçü aracını kullanın. Bu 20 x referential koordinatlar çekirdeğin şematik bir çizim üzerinde her ağın konumunu ifade etmek için yararlıdır. Verileri özetlemek için çekirdeğin dikdörtgen olarak normalleştirilmesi kullanılır.
Bunu yapmak için, yeniden boyutlandırılmış dört x görüntüdeki çekirdeği çevreleyen çokgen aracını kullanın. Ardından YG yöneticisini açın ve çizilen yg'yi ekleyin. Çekirdeğin kenarlıkları görülemiyorsa, bu durumda önce yeniden boyutlandırmayı unutmayın.
Ayarölçümünde, çizilen çekirdek içindeki en küçük dikdörtgeni hesaplamak için sınırlayıcı dikdörtgen seçeneğini seçin. Son olarak, ölçü'ye tıklayın ve ardından sınırlayan dikdörtgen tarafından temsil edilen normalleştirilmiş bir çekirdekteki etiketli hücre koordinatlarını ifade etmek için yazılı protokoldeki adımları izleyin. SR101 etiketli trigeminal ana duyusal çekirdeğin dorsal kısmındaki tek bir astrosit, tüm hücre kaydı için hedeflenmiş ve %0.2 biyositle doldurulmuştur.
Beşinci sistemin elektriksel stimülasyon trigeminal ana duyusal çekirdeğin dorsal kısmında biyositin etiketleme arttı, birleştirilmiş hücre sayısında bir artış temsil eden. Astrositik ağlar trigeminal ana duyusal çekirdeğin dorsal kısmı ve ana yönelimi içinde sınırlı kalır. Bu teknik, tanımlanmış bir yapı içinde astrositik ağları konumlandırmak için geliştirilmiştir, ancak herhangi bir yapıda etiketli hücre popülasyonunun konumunu ifade etmek için kullanılabilir.
