The authors have nothing to disclose.

Bu çalışma Tıp Bilimleri İran Üniversitesi Etik Komitesi (Tahran, İran) tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (NIH) için Kılavuzu&#39;nda belirtilen politikalara uygun olarak yürütülmüştür. 1. Hayvanlar, Cerrahi ve Numune Hazırlıklar NOT: 3D odaklı mikroskopik analiz için beyin dokusunu hazırlayın. <ol><li> Iki gruba rastgele Divide hayvanları: Aβ 1-40 -injection (n = 8) ve genistein, tedaviden Aβ 1-40 -injection (n = 8); ameliyat öncesi sonda 1 saat ile genistein (örneğin, polietoksile hint yağı gibi bir araç içerisinde seyreltilmiş 10 mg / kg) tatbik. </li><li> Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile anestezi. Ayak sıkıştırdıktan sonra geri çekme refleksi eksikliği ile doğru anestezi onaylayın. Kuruluğunu önlemek için ameliyat sırasında göze merhem kullanın. </li><li> Stereotaksik aparat ve tıraş baş hayvanları yerleştirin. IoD Uygulaine çözüm insizyon yapılmadan önce derisini temizlemek ve enfeksiyon riskini azaltmak için ameliyat sırasında steril operasyon siteyi tutmak için. Sıçan beyin atlas 8&#39;e göre, bregma -3.5 mm posterior, orta hatta kadar ± 2 mm lateral ve dura altında -2.8 mm hipokampus Aβ 1-40 stereotaxically (4 ul) enjekte edilir. Stereotaksik yöntem için bir önceki yayın 9 bakınız. </li><li> Hayvanlar hayvanların rahatı için tam bilinçli kadar post-operatif gözlem / bakım sağlar. Kurtarma sırasında sıcak hayvanları tutun ve tam iyileşme kadar diğer hayvanlarla bir kafese dönmelerini yok. Ameliyattan sonra hayvanlarda enfeksiyon belirtisi dikkat edin. </li><li> Üç hafta ameliyat sonrası ketamin (150 mg / kg) ile derin hayvanların anestezisi. 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde% 4 paraformaldehit ve ardından% 0.9 tuzlu su hayvanları perfüze transcardial tespit gerçekleştirmek, çıkarıp 10 de tarif edildiği gibi &lt;beyin tamir/ sup&gt;. </li><li> 4 ° C&#39;de 2-3 gün süreyle% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası sabitleyin. </li><li> Doku gömme ekipman kullanımı ile parafin blokları doku gömün ve doğru hizalama ya da kesit engel olabilir çünkü dolum-under veya aşırı doldurma kaseti kaçının. Parafin blok içinde doku yönüne dikkat edin. NOT: Sıçan hipokampus, örneğin, serebral hemisferin posterior kısmına yakındır. Böylece doku şekilde gömülü olmalıdır beynin posterior kısmında kesit başlar söyledi. Istenen anatomik yapıyı ulaşmak için bir rehber olarak Paxinos atlas 8 kullanın. </li><li> Hava hareketleri zor bölümlerden işlenmesini yapmak beri uzak, hava taslaklar veya kapı gelen mikrotom yerleştirin. </li><li> Bu derinlik gerekli olduğu gibi tam astrositlerin Z-Stack görüntüler üretmek için bir kalınlık ≥20 um ile bölümleri kullanın. Onlar istenmeyen kalınlığa sahip olabilir ısıl e, ilk çift bölümleri kullanmayınXpansion. </li><li> (5 ± 2 ˚C, parafin erime sıcaklığının altında) sadece yeterince uzun bölümler düzleştirmek için ılık su yüzeyinde bölümleri yerleştirin. NOT: bölümün genişleme yapısının morfoloji rahatsız edebilir Aşırı. Dikkatle bölümleri aktarmak için minik fırça kullanın. Her slaytta iki ya da üç bölümden toplayın. </li><li> Mağaza dik bir pozisyonda rafa slaytlar ve çeşitli saat veya O / N 37 ° C&#39;de kurumaya bırakın. </li></ol> 2. İmmünhistokimya <ol><li> Deparaffinize ksilen bölümler, 2 x 10 dakika, ve alkol gradyanı ile (99.8,% 95 ve% 70,% 10 dk) ve PBS rehidrate. </li><li> % 0.25 sığır serum albümini (BSA),% 0.25 Triton X-100 ve% 3.5 normal serum (4 ° C&#39;de O / N) içeren PBS içinde 1500: glial fibriler asidik protein (GFAP) yönelik antikorlar ile inkübe 1 seyreltilmiştir. </li><li> 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın. </li><li> İkincil alkalin fosfat ile konjüge edilmiş Antikorların kuluçkalayın1 saat s (PBS içerisinde 1: 100 seyreltilmiş, 21 ° C,). </li><li> 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın. NOT: Bu arka plan boyama en aza indirmek için ikincil antikorlar sonra düzgün bölümleri yıkamak önemlidir. </li><li> Sıvı Daimi Kırmızı kromojeni (15-20 dk) ile karanlıkta bölümleri inkübe edin. Not: Kullanımdan önce en fazla 30 dakika çözeltisi hazırlayın. </li><li> 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın. </li><li> Son olarak, 4-6-diamidino-2-fenilindol çekirdekleri leke (DAPI; PBS içerisinde 1: 500 seyreltilmiş), önceden kapak-kayma. Mikroskopi önce buzdolabı 24-48 saat slaytlar saklayın. </li></ol> 3. Konfokal Mikroskop NOT: kantitatif değerlendirme (aşağıya bakınız) için, hata riskini azaltmak için şube örtüşen minimum açıkça görülebilir DAPI lekeli çekirdeğe sahip bir astrosit seçin. Z-Stack görüntüler üreten zaman alıcıdır. Sabırlı olun ve işleme sırasında bitmiyor. Dik konfokal lazer tarama mikroskobu u olduğuastrositlerden 3D görüntüler oluşturmak için sed. <ol><li> Mikroskop-sahnede slayt yerleştirin ve 63X objektif seçin. </li><li> Görüntüleme yazılımı açın ve Start sisteminde tıklayın. Locate sekmesine tıklayın. Ata gidin ve uygun ışık ayarlamak için GFP seçin. </li><li> Işığı yansıtmak için Shutter açın. Shutter sağ tarafındaki Reflektör Revolver bulun ve astrositler (yeşil, kırmızı veya mor) tarafından yansıtılmalıdır rengi seçin; (FSet20 wf) kırmızı renk burada kullanıldı. NOT: mikroskobunun oküleri doğrudan resmi odaklanmak unutmayın. </li><li> En iyi Odağı bulmak için, tüm kapalı tıklayın ekran modunda mikroskop pimini koymak ve Toplama sekmesine tıklayın. </li><li> Toplama sekmesi altındaki Akıllı Kur tıklayın; Bir pencere açılır. Listeden (geçerli proje yani DAPI ve Alexa Fluor 555) uygun fluorofor seçin. Renk otomatik olarak seçilir. </li><li> En iyi sinyal üzerine tıklayın ve uygulayın, ardından Set Pozlama tıklayın; Daha sonra bilgisayar otomatik olarak pozlama parametrelerini ayarlamak olacaktır. </li><li> Görüntüyü optimize için Kanallar penceresine gidin. Kaldır Track2, Track1 vurgulayın ve canlı tıklayın. Gerekirse görüntü odaklanın. </li><li> Kanallar penceresinde aşağıdaki anahtarları ayarlamak; otomatik iğne deliği optimize etmek 1AU tıklayın. Aksi takdirde konfokal görüntüleri optimal olmayan olacaktır bu adımı yapmak çok önemlidir. En iyi yoğunluğunu (ekstra gürültüyü azaltmak için 800 altında bu ayarı tutmak) için Kazanç ayarlayın. Son olarak, 2 ve 3 arasında Dijital Kazanç ayarlayın. </li><li> Kaldır Track1 Track2 tıklayın ve Track2 için Adım 3.8 tekrarlayın. Sonra Canlı dur. </li><li> Toplama Modu penceresine gidin. Çerçeve Boyutu optimize ve Averaging görüntüyü geliştirin. Değiştirmek için çerçeve boyutu X * Y gidip x 1,024 1.024 seçin. Daha iyi bir görüntü oluşturmak için yavaş Speed ​​seçin. </li><li> Ortalaması gidin ve Numara ≥4 seçin. Bu ortalama değer özel üretmek için ortalama edilecek taramaların sayısını gösteriredinilen görüntüyü e. Şimdi Yapış düğmesini tıklatın ve yakalanan 2B görüntüyü kaydedin. </li><li> 3D görüntüleme için, Z-Stack penceresi açmak için neden Akıllı Kur kapsamında Z-Stack öğeyi işaretlemek. </li><li> Hücrenin derinliği, yani Z-Yığın için ilk ve son pozisyonları ayarlayın. İlk Canlı tıklayınız. Sonra Z-Stack başlatmak için dokuda astrosit en üst pozisyona odaklanmak için mikroskop odak sürücü kullanın. Set İlk tıklayın. Sonra Z-Stack tarama kesilmelidir dokuda astrosit en düşük pozisyona aşağı odaklanın. Set Son üzerine tıklayın. Sonra Canlı dur. </li><li> Aralığı Seçin; 1.01 mikron Bu çalışmada kullanılan; seçme aralığı dilim sayısını ayarlamak için Optimal tıklayarak yapılabilir. </li><li> Başlat Deneyi tıklayın. Tarama tamamlandığında görüntüleri kaydetme. Yüzey alanı ve astrosit topraklarının hacmi, tüm astrosit dahil sutyen: Bu görüntü aşağıdaki parametrelerin ölçümü için kullanılacaknches hücre gövdesi ve çekirdek. </li><li> Adımlar 3,6-3,11 de tarif edildiği gibi, bir 10X ya da 20X objektif kullanarak bir 2D görüntü elde. Bu görüntü ölçümü için antikorların floresan immüno ve astrosit yoğunluğu (sayı / 1000 um 2) yoğunluğu kullanılabilir. </li></ol> 4. Astrosit yoğunluğu ve GFAP + Floresans yoğunluğu <ol><li> 20X 2B görüntü açın. Görüntü penceresinin sol tarafındaki Histo (Hisogram) tıklayın. </li><li> Astrosit yoğunluğunu hesaplamak için, 20X objektif altında arka arkaya üç görsel alanları seçin. Alanlarda şube örtüşen, minimum net soma sergileyen astrositlerde sayısını. </li><li> Floresan ölçmek için, görüntü penceresinin altbilgi üzerinde uygun bir alet (dikdörtgen veya daire) seçin ve ölçümü için bir alan seçin. Ortalama değer ve standart sapma görüntünün altında otomatik olarak görünür unutmayın. Str arasındaki mevcut çalışmada, 0.7 mm 2 dikdörtgen alaniatum ve dentat girusun medial bıçak kullanılmıştır. </li></ol> 5. Astrosit Şubeler <ol><li> Şube uzunluğu ve toplam sayısını ölçmek için, görüntü analiz yazılımı (20X ile kazanılmış) 3D görüntüler kullanın. Seçilen astrosit her dalının uzunluğu boyunca elle bir çizgi çizin. Sonra hat-uzunluk ölçmek için uzman ölçme-aracını seçin. Şube sayısını ölçmek için, işaretli öğelerin sayısını saymak için sayım aracını seçin. </li></ol> 6. Hacim ve Yüzey Alanı NOT: 3D görüntü analiz yazılımı elle bir yapıya işaretleme odak ve eğitim gerektirir. Bir deney başlamadan önce birkaç kez uygulayın. <ol><li> Astrosit çekirdeğinin, soma, hücre gövdesi ve toprak hacim ve yüzey alanı ölçmek için, örneğin Volocity 6.1 gibi 3D görüntü analiz yazılımı (Merdivenleri 3,1-3,16 elde) 3D görüntü aktarmak. </li><li> Yazılımını açın ve yeni bir oluşturmakkütüphane. Yeni kütüphanede sol gri sütuna tüm görüntüleri sürükleyin. Sonra bir 3D görüntü seçin. Sağda, farklı renklerde, farklı kanallar vardır. Çevrede bir kanalda açın; Örneğin DAPI için mavi kanal çekirdeğe ölçerken. Optimal kontrast elde etmek için elle parlaklığını değiştirin. </li><li> Araçlar menüsünü seçin, Ses yapın ve Z-yığın görüntüleri dışarı tek bir 3D görüntü üretmek için gidin. Düzen menüsünde Özellikler&#39;i tıklatın ve X, Y ve Z özellikleri sunulmaktadır emin olun; aksi takdirde 3D analizlerini yürütmek mümkün değildir. </li><li> Araç çubuğundaki Freehand RIO aracı simgesini tıklayın. Astrosit çekirdeğinin hacmi ve yüzey alanı ölçmek için DAPI etiketli çekirdeği etrafında bir çizgi çizin. </li><li> Astrosit hücre gövdesi hacmi ve yüzey alanı ölçmek için şubeler hariç soma etrafında bir çizgi çizin. </li><li> Tüm astrosit (şubeler dahil hücre gövdesi) hacmi ve yüzey alanı ölçmek için aşağıdaki soma etrafında bir çizgi çizintüm branşlarda yüzey. </li><li> Astrosit topraklarının hacmi ve yüzey alanı değerlendirmek için şube uçları arasına bir çizgi çizin. NOT: Basın istenmeyen çizimleri silmek için klavyedeki Delete. </li><li> Bir ölçüm protokolünü oluşturmak için görüntü penceresinin üst kısmında ölçümler menüsüne tıklayın; farklı araçlar içeren bir pencere açılır. </li><li> Sürükle penceresi (bölme) üstüne nesneleri bulun. Nüfus 1 açıklayıcı bir ad verin ilişkili rengi seçin ve Tedbir tıklayın. Başka bir pencere açılır. </li><li> Bir parametre, yani hacim veya yüzey alanı seçin. Tamam&#39;a tıklayın. Veriler tabloda görünecektir. </li><li> Ölçüm menüsünde veri tıklayınız kaydetmek ve Ölçüm Item seçeneğini belirleyin. </li><li> Açılan pencereden adlı yeni bir ölçüm öğesini seçin. Sonra verilere bir ad verin ve Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> Son olarak, Graph ped olarak istatistik yazılımı veri ihracat veya programı excel. Verileri analiz t-testi kullanın, ardından 2B gr arsaAPHS. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

Bu çalışma Tıp Bilimleri İran Üniversitesi (Tahran, İran) Östergötland County Konseyi (İsveç) ve Hücresel ve Moleküler Araştırma Merkezi hibe ile desteklenmiştir.

Geçerli protokol, astrosit morfolojisi ile ilişkili 12 farklı parametrelerini değerlendirmek için 3D konfokal morfometrisi kullandı. Bu amaçla, Aβ 1-40 olan sıçanların hipokamp dokusunda - ya da bir anti-enflamatuvar ajan olarak genistein, ön muamele olmaksızın uyarılan astrogliyozun kullanılmıştır. 3D görüntüler ve morfometrik yazılımını kullanarak, astrositlerde morfolojisi yani astrogliyozun üzerinde genistein etkisini göstermek başardık. <p class="jove...

Sağlıklı, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde, astrositler, kan akışı, enerji metabolizmasında, sinaptik fonksiyon ve plastisite ve hücre dışı iyon düzenlenmesinde önemli bir rol oynarlar ve nörotransmitter 1-3 homeostazı. Buna ek olarak, astrositler farklı zararlı uyaranlara ve hipertrofisi, çoğalması ve astrositler 4,5 fonksiyonel biçimlenme ile karakterizedir reaktif astrogliyozun yoluyla travma, enfeksiyon, iskemi veya nörodejenerasyon gibi anormal şartlarda cevap. Reaktif astrogliasis terapötik girişimlerin klinik sonuçlarını etkileyebilir, bu nedenle, dokuda inflamatuar yanıtı ve onarım sürecini mühendis ve olabilir. Buna göre, astrocytes MSS etkileyen hastalıkların çeşitli terapötik müdahaleler için potansiyel hedefler olarak son yıllarda nörobilimci dikkati aldık. Astrositler normalde iyi-d ile stellat şekli varsoma 6 çevresinde yayıldı efined dalları. Beyindeki hastalıklı durumda, astrosit dalları kıvrık hale gelir ve amiloid beta (Aβ) mevcudiyetinde, örneğin, şiş uçları 7 göstermektedir. Bu makale konfokal mikroskobu ile elde edilen astrositlerin 3D görüntüleri analiz etmek için bir protokol sunar. Her astrosit için on iki farklı sayısal parametreler ölçüldü: yüzey alanları ve astrosit topraklarında (bir astrosit kaplı dokusu), (şubeler dahil) tüm hücre, hücre gövdesi ve nükleus hacimleri; Toplam uzunluğu ve şube sayısının; astrosit tespiti için kullanılan antikorların flüoresan yoğunluğu; ve astrositlerde yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2). Bu amaçla, ya da bir anti-enflamatuvar madde olarak genistein muamelesi olmadan Aβ 1-40 enjeksiyon intrahipokampal maruz farelerin beyin bölümleri kullanılır. Açıklanan protokol morfometrik An için kullanılabilirin vitro veya farklı koşullar altında in vivo olarak farklı hücre tipleri Analizi.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Beyindeki glial hücreleri gibi, astrositler, merkezi sinir sistemindeki çeşitli işlevsel rolleri vardır. Zararlı uyaranların varlığında, astrositler işlevsel ve yapısal özellikler, reaktif astrogliasis denilen bir durum değiştirir. Burada, astrositler morfolojik özelliklerin değerlendirilmesi için protokol verilmektedir. Bu protokol şube yüzey alanı ve bir astrosit (astrosit topraklarında) kapsamında dokusu, şube, hücre gövdesi ve nukleus dahil olmak üzere tüm astrosit, hacmi, yani 12 farklı parametrelerin ölçümü yanı sıra toplam uzunluğu ve numarasını içeren, şiddeti astrosit tespiti için kullanılan antikorların floresan immünoreaktivitesinin ve astrosit yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2) evi. Volocity 6,3 ölçümleri için kullanılmıştır gibi, bu amaç için, üç boyutlu (3D) odaklı mikroskopik resimleri oluşturulur, ve 3 boyutlu görüntü analizi yazılımı gibi bulundu. Amiloid beta 1-40 maruz Sıçan beyin dokusu </ya da terapötik bir müdahale olmaksızın alt&gt; (Aβ 1-40) bir yöntem mevcut için kullanılmıştır. Bu protokol, aynı zamanda, in vivo ya da in vitro koşullarında ya da diğer hücre 3D morfometrik analizi için kullanılabilir.

Bu bölüm 3B morfometrik analizi ile üretilen, nicel ve nitel gözlemlere ilişkin bazı örnekler verilmektedir. Daha önce de belirttiğimiz 12 parametrelerin tam sonuçlar için, önceki yayın 10 bakın. Nitel Gözlemler Astrositler Aβ 1-40 enjekte sıçanlar (Şekil 1) genellikle uzun olan ince veya kalın dalları sergiledi. Kısa dalları ile birkaç küçük stellat şeklindeki astrositler serebral korteks gözlen...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Görüntüleme.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Video: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Nörobilim

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

Mantar şeklinde papilla Amaç Analizi Denver Papilla Protokolü

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Beyin Yapılarının Üç Boyutlu Şekil Modellemesi ve Analizi

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.