Bu eser NIH (R21NS093199) ve UCLA ARC 3R's ödül fon ile desteklenmiştir. En içten teşekkürlerimizi Dr Harley Kornblum HK301 ve HK157 hücre hatları sağlanması için laboratuara gidin. Biz Ayrıca UCLA doku patoloji çekirdek Laboratuvarı (TPCL) cryosectioning için gelişmiş ışık mikroskobu/spektroskopisi çekirdek tesisi (sadaka) UCLA California Nanosystems Enstitüsü (CNSI) içinde confocal mikroskop, UCLA Institute for Crump kullanımı için teşekkür ederiz IVIS görüntüleme sistemi, UCLA moleküler araçları Merkezi (manyetik rezonans spektroskopi ve akış sitometresi çekirdek içinde Jonsson kapsamlı Kanser Merkezi (JCCC) UCLA akışı için araçları sağlamak için sağlamak için mikrofon) kullanmak için moleküler görüntüleme sitometresi.

Tüm insan dokusu koleksiyonu adımları kurumsal olarak onaylanmış protokolleri altında yapılmıştır.
1. hyaluronik asit Thiolation
Not: Molar oranları aksi belirtilmedikçe karboksilat Grup toplam sayısı ile ilgili olarak ifade edilir.
<ol><li>Sodyum hyaluronate (HA, 500-750 kDa) 500 mg 10 mg/mL deiyonize, distile su (DiH2O), 250 mL Erlenmeyer flask steril bir Otoklav içinde geçiyoruz. HA tamamen erimesi 2 saat oda sıcaklığında çözüm (~ 200 devir/dakika) karıştırın. Bir heyecan bar ve manyetik heyecan plaka thiolation işlem sırasında karıştırarak tepki tutmak için kullanın.</li>
	<li>0.1 M hidroklorik asit (HCl) kullanarak, pH 5.5 HA çözeltinin ayarlayın. 69,6 mg (molar oranı x 0,25) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) tartmak. Not: her ne kadar undissolved EDC HA çözüm doğrudan eklenebilir, EDC, ilk 1 mL DiH2O dağıtılması ve daha sonra hızlı bir şekilde EDC çözüm HA ekleyin genellikle daha kolaydır. Öncesi fesih DiH 1 ml2O da N-hydroxysuccinimide (NHS) ve cystamine dihydrocholoride ile adım 1.3 ve 1.4 tepki eklemeden önce yapılabilir.</li>
	<li>17.9 mg (molar oranı x 0.125) NHS için tepki ekleyin. 45 dakika oda sıcaklığında tepki kuluçkaya ve pH 5.5 0.1 M HCl kullanarak tepki çözeltinin ayarlayın.</li>
	<li>70.0 mg (molar oranı x 0,25) cystamine dihydrochloride tepki çözüm ekleyin. 0.1 M sodyum hidroksit (NaOH) pH 6,25 için ayarlamak için kullanın. Gecede karıştırma sırasında oda sıcaklığında tepki kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, 1 M NaOH pH 8 için tepki çözeltinin ayarlamak için kullanın. 192 mg (4 molar oranı x) dithiothreitol (DTT) için tepki ekleyin. PH 8 başa DTT eklenmesinden sonra ayarlamak ve karıştırma için 1-2 saat oda sıcaklığında bırakın.</li>
	<li>1 M HCl pH 4'e ayarlamak için kullanın. Tüm reaksiyon karışım öncesi diyaliz membran (moleküler ağırlık kesme 13 kDa çevresinde) içine aktarmak ve DiH karşı diyaliz2O önceden ayarlanmış pH 4. Not: En az 40 kez tepki HA çözüm (Örneğin, 2 L / DiH2O, pH 4 50 mL örnek) hacmi DiH2O diyaliz için hacmi olmalıdır.</li>
	<li>Diyaliz çözüm (DiH2O, pH 4) iki kere oda sıcaklığında 3 gün boyunca her gün değiştirin.</li>
	<li>Diyaliz solution'ı 0,22 µm Membran Vakum tahrikli filtre filtre. Donma çözüm thiolated HA sıvı azot, flash. Kuru örnekleri 2 gün içinde dondurmak için bir lyophilizer kullanın. Thiolated HA kuru formunda bir Kasa'da desiccator-20 ° C'de en az 6 ay süreyle saklanabilir.</li>
	<li>Thiolation derecesini belirlemek için Ellman'ın test ve/veya proton NMR spektroskopisi30,31kullanın.</li>
</ol>2. Crosslinking malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Thiolated HA, HEPES arabelleğe alınmış serum fizyolojik (20 mM HEPES Hank'in dengeli tuz tuz çözeltisi (HBSS) arabelleği, pH 8-9 içinde düşmeye düzeltilmiş) içinde (Bu örnekte, 13,3 mg/mL) konsantrasyon istenen ortam ışığa maruz kalma en aza indirmek için bir kehribar şişe geçiyoruz. Sürekli karıştırarak çözüm tutmak. Not: Disülfür bağları HA Birleşik thiols arasında oluşumu pH 8 olduğunu, çözüm konsantrasyonu çok yüksek olduğunu, ya da çözüm için çok uzun süre önce jelleşme karıştırarak kaldıysa oluşabilir. Bu sorunu önlemek için 15 mg/mL thiolated HA kullanın ve thiolated HA hydrogels oluşturan 2 saat içinde çözülür.</li>
	<li>4-kol-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) ve 4-kol-PEG-thiol (PEG-thiol, 20 kDa) 50 mg/mL PEG-Mal ve PEG-thiol hisse senedi çözümleri hazırlamak için fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4, içinde çözülür. Not: Bu tam olarak PEG reaktifler çözülmeye en az 1 saat alır.</li>
	<li>Eğer ECM kaynaklı peptidler ekleyerek, sistein içeren peptidler içinde hisse senedi bir çözüm hazırlamak için PBS çözülür. Not: bir hisse senedi toplama 2-4 mm kullanın.</li>
	<li>Emmek silikon kauçuk etanol için en az 20 dk için temiz onları ve sonra Otoklav içinde onları sterilizasyon için kalıplar.</li>
</ol>3. hidrojel Crosslinking ve hücre kapsülleme
Not: örnek olarak, dört kişi, 80 µL hydrogels %0,5 (w/v) HA ve 1 kPa basınç modülü encapsulation açıklanan3işte. Tablo 1 hydrogels değişen özellikleri ile verim örnek yemek tarifleri için bakınız: integrin bağlama peptid RGD birleştiren iki hydrogels ve iki hydrogels peptid etkinliği için bir negatif kontrol olarak sistein caps ekleme. GBM hücre hasta elde edilen konsantrasyon tohum 500.000 hücreler/ml'dir.
<ol><li>PEG-Mal stok çözüm (50 mg/mL, adım 2.2) 12.5 mg/ml 120 µL PBS'ye hisse senedi çözüm 40 µL ekleyerek sulandırmak. Böylece her tüp 80 µL seyreltilmiş çözüm iki 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine bölünmüş.</li>
	<li>16 µL stokunun RGD çözüm (adım 2,3 2,8 mM) bir tüp ve hisse senedi sistein çözüm (adım 2,3 2,8 mM) ikinci tüp 16 µL ekleyin. Girdap karıştırmak için. PEG-Mal-RGD veya PEG-Mal-CYS çözümler adım 3.9 kullanımda kadar buza koyun. Not: burada verimleri hydrogels peptid ~ 140 µM ile açıklandığı yordam. Bu yaklaşık 1 8 her kullanılabilir PEG silah ile bir peptid işgal dışında için eşdeğerdir. Bu peptidler sistein sonlandırılmış kullanılabilir maleimide gruplarına molar oranını değiştirerek değiştirilebilir. Genel olarak, peptid 280 µM maksimum konsantrasyon hala maleimide grupların hidrojel crosslinking için kullanılabilir yeterli sayıda bırakarak elde edilebilir.</li>
	<li>5 mg/ml PEG-thiol hisse senedi çözüm (50 mg/mL, adım 2.2) olarak 50 mg/mL 4 µL hisse senedi çözüm PBS 36 µL ile karıştırılarak sulandırmak. Çözünmüş, thiolated HA, 120 µL 2.1 adımından karışıma ekleyin. Not: HMW HA çözümleri çok yapışkan. Böylece, geniş orifis micropipette uç çözümler aktarmak için kullanmanızı öneririz. Yavaş yavaş çözüm micropipette ipucu duvarlara yapışmasını önlemek için ve ölçüm doğruluğu artırmak için pipet.</li>
	<li>Temiz, Kuru kalıpları (2.4 adımda hazırlanan) doku kültürü tedavi 12-şey plaka her kuyunun içine yerleştirin. Pipet Ucu, temiz, künt sonuna kullanarak, jel kalıp ve iki kez kontrol sızdırmazlık kalıpları ve alt iyi plaka arasında basın. Not: daha önce Şu kapsülleme kaçağı önlemek için kontrol.</li>
	<li>Kültürlü GBM hücreleri geçiş, tek kişilik hücrelere ayırmak ve hücre konsantrasyonu daha önce3açıklandığı gibi belirlemek. Not: Bazı GBM satır tek hücrelere ayrışmış olamaz. Bu durumda, tüm gliomaspheres saklanmış. Ancak, tekrarlanabilirlik geliştirmek için kesin hücre sayımı sonra Disosiye tek hücreleri hazırlayın. Gliomasphere passaging için protokol farklı labs arasında değişir ve bunların çoğu büyük olasılıkla hidrojel kapsülleme ile uyumludur.<ol>
<li>(Önerilen) Santrifüj gliomaspheres 5 dakika süreyle 500 x g de süpernatant çıkarın ve 1 mL hücre ayrılma enzim hücre Pelet ekleyin. Daha sonra hafifçe dokunarak kışkırtmak için tüp 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Tam kültür orta (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL heparin, G21 ek ve % 1 penisilin/streptomisin DMEM/F12) 4 mL hücrelere ekleyin.</li>
		<li>500 x g 5 min için de yine santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Son olarak, hücre pelet 1 mL tam orta resuspend ve askıya alınan hücreler 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. (Önerilen) yıkama süzgeç hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için tam orta bir ek 4 mL ile kurtarıldı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücrelerde bir hemasitometre kullanarak süspansiyon konsantrasyon tahmin ediyoruz. Hücre süspansiyon burada her tüpün ~ 80.000 hücreleri içeren 2 santrifüj tüpler içine bölünmüş. 500 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi; Genel olarak, 80.000 hücreleri 2 80 µL hydrogels kadar yapacak.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve bir Pelet 80 µL PEG-MAL-RGD çözüm ve ikinci bir Pelet 80 µL PEG-MAL-CYS çözüm (3.1 adımda hazırlanan) içinde resuspend.</li>
	<li>Bir 200 µL, geniş orifis micropipette ipucu kullanarak, HA çözümden (yukarıdaki adım 3.3) 40 µL (3,4 adımda hazırlanırken) her kauçuk silikon kalıp içine dağıtmak.</li>
	<li>Bir 200 µL, geniş orifis micropipette ipucu kullanarak, 40 µL PEG-MAL-CYS veya PEG-MAL-RGD hücre çözümü HA çözüm kalıp ile karıştırın. Yukarı ve aşağı hızlı bir şekilde en fazla 10 kez pipet. Hazırlıklı olmak her jel kültür için yineleyin. Not: ilk jelleşme hızlı bir şekilde oluşur bu yana bu adımı pratik, ister (30 içinde s). Yukarı ve aşağı kalıpları bile karıştırma sağlamak için farklı konumlarda için belgili tanımlık uç hareket ederken pipet. Her zaman ipucu hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için sıvı seviyesinin altında tutun. Çözüm çok kez jel micropipette içinde oluşan gibi ipucu mix yapmak. PEG-MAL-CYS ve PEG-MAL-RGD istenen RGD peptid toplama ulaşmak için değişen oranlarıyla birleştirilebilir.</li>
	<li>5-10 dakika tepki tamamlanmasını sağlamak 37 ° C hücre kültür kuluçka içine jel kapsüllenmiş hücreleri içeren iyi plaka yerleştirin.</li>
	<li>2-2.5 mL kültür ortamının her şey ile kurulan jelleri ekleyin. Bir steril, 2 µL pipet ucu veya mikro-spatula, nazikçe kalıp ve jel ayırmak için kullanın. Önceden sterilize forseps kalıp iyi plaka kaldırmak için kullanın. Hücre inkübatör (37 ° C ve % 5 CO2) kültür ve gelecekteki deneyler için iyi plakasına geri yerleştirin. Not: jel kültürler zarar önlemek için kalıp dikey olarak yukarı doğru çekin. Genel olarak, jel kültürler ortamda her 3-4 günde değiştirilmelidir. Hydrogels orta kaldırırken Aspire değil için dikkat ediniz. Bir sorun olursa, bir plastik transfer pipet kullanmanızı öneririz. Eğer cep numarasını izlemek için Imaging bioluminescence planlanmış, GBM hücreleri yapısal kodlama luciferase ifadesinden önce kapsülleme, yukarıda açıklanan3olarak lentivirus ile transduced gerekir. Bioluminescence görüntüleme için kültür orta ışıldama görüntüleme önce 1 h D-biyoluminesans 1 mM ekleyin.</li>
</ol>4. lysate hazırlığı Batı kurutma
<ol><li>Üzerine buz (1 jel örnekleri başına) 1.5 mL microcentrifuge boruları, sakin ol. Serin santrifüj ile 4 ° c</li>
	<li>Orta iyi plakaları kaldırın. Jelleri prechilled microcentrifuge tüpler içine aktarın.</li>
	<li>RIPA arabelleği 1 x proteaz/fosfataz inhibitörleri ile 100 µL ekleyin.</li>
	<li>1 mL 20 G iğne ile kullanarak, jel kadar en az 20 kez iğne tüm karışımı iterek kır.</li>
	<li>Spin tezgah en iyi microcentrifuge ve örnek geri buza yer kullanarak örnek flash.</li>
	<li>Girdap kısaca her 5 dk toplam 20 dk örnekler.</li>
	<li>Santrifüj örnekleri 4 ° C'de 15 dakika 14000 x g de</li>
	<li>Yeni, önceden soğutulmuş microcentrifuge tüpler süpernatant aktarın ve depolayın (kısa vadeli)-20 ° C'de veya ve-80 ° C (uzun vadeli). Jel Elektroforez standart prosedürler, yukarıda açıklanan3kullanarak gerçekleştirin.</li>
</ol>5. açılan tek hücreler için akış sitometresi hidrojel kültürlerden
<ol><li>Orta ve transfer jel Kültür (Kimden adım 3.11) 1.5 mL microcentrifuge tüpüne kaldırın.</li>
	<li>Jel hücre ayrılma enzim (Örneğin, TrypLE Express) zaman zaman kışkırtmak için tüp flicking 5 min için 37 ° C'de 500 µL ile kuluçkaya.</li>
	<li>Karışımı bir 50 mL santrifüj tüpü ile 5 mL tam orta içine aktarın. Tüp buza koyun.</li>
	<li>20 G iğne bir 10 mL şırınga üzerine ekleyin. Yavaşça hücre süspansiyon 8 kere iğne ile yukarı ve aşağı çekin.</li>
	<li>Karışımı bir yeni 50 mL santrifüj tüpüne 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla akış. Bir ek 5 mL tam orta de kalan hücreleri toplamak için süzgeç aracılığıyla uygulanır.</li>
	<li>5 dk. süpernatant kaldırmak ve Pelet istenen arabelleği akış sitometresi (standart protokolleri3kullanarak) için resuspend örneği 400 x g'santrifüj kapasitesi.</li>
</ol>6. Hydrogels kesit için dondurma
<ol><li>Orta jel kültürler (Kimden adım 3.11) kaldırın.</li>
	<li>%4 paraformaldehyde (PFA) 2 mL jel kültürlerle gecede 4 ° C'de kuluçkaya. Dikkat: PFA toksik ve dikkatle ele alınması gerekir.</li>
	<li>Ertesi gün, İngiltere'de yılın kaldırın. 2 mL % 5 sükroz PBS içinde jeller için ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>PBS % 20 sukroz 2 mL % 5 sükroz çözüm yerine ve 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>PBS taze % 20 sukroz 2 mL sukroz çözüm yerine ve ek bir 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Üçüncü kez, PBS taze % 20 sukroz 2 mL sukroz çözüm yerine. 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>En iyi kesim ısı (OCT) bileşik % 20 sükroz hazırlayın. Not: nedeniyle viskozite, Ekim, sukroz dağılması biraz sürebilir (en fazla bir gecede) zaman. Biz karışımı bir shaker ajitasyon korumak için dağılması sırasında koyarak öneririz.</li>
	<li>Ertesi gün, % 20 sükroz çözümü kaldırmak ve yavaşça % 20 sükroz OCT çözümde jel dökün. Tüm jel karşılamak emin olun. 3 h için 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Jel büyük, düz bir spatula kullanarak bir gömme kalıp merkezine transfer; Bu jel zarar görmesini önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.</li>
	<li>Serin 2 methylbutane aşırı kuru buz ile bir Kriyo içinde.</li>
	<li>Gömme kalıp saf OCT (sukroz) ile doldurun. İçin sadece kalıp üst kenarını doldurun.</li>
	<li>Hidrojel örnek daldırma tarafından soğutmalı 2-methylbutane içinde dondurmak ve kesit için devam edin.</li>
	<li>Bölüm bir cryostat kullanarak örnek; 10-18 µm kalınlığı bölümünde ve yaklaşık-26 ° c parça sıcaklık önerilir.</li>
	<li>Standart immunostaining yordamları kesitli jel kültür, yukarıda açıklanan3olarak gerçekleştirmek. Not: PFA tahriş edici ve kanserojen bilinir. Lütfen idare ve yerel olarak geçerli standartlara ve düzenlemelere göre İngiltere'de yılın atmayın.</li>
</ol>7. Toplam RNA çekme--dan hidrojel örnekleri
Not: Burada, bir ticari bir iletişim kuralı'nı tarif (malzemeleri tablo görmek) Toplam RNA kültürlü hidrojel hücrelerden ayıklamak için kit. Arabellekleri ve tüm malzeme kullanılan kiti içinde mevcuttur.
<ol><li>Kültür orta kaldırın. P1000 transfer pipet wide-geçişli ucuyla hidrojel kültür 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarmak için kullanın.</li>
	<li>350 µL arabelleği RLT hidrojel kültür ekleyin.</li>
	<li>1 mL şırınga bağlı 20 G iğne kullanarak, jel en az 20 kez iğne tüm karışımı iterek bile olmamalı.</li>
	<li>Tüm karışımı bir 2 mL toplama tüpü homogenizer sütun içine aktarın. 13.000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Jel çökelti alt bozmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Lysate örnek % 100 etanol 350 µL ile karıştırın. Tüm örnek bir spin sütundan (kit) yerde 2 mL toplama tüp aktarın. Santrifüj 13.000 x g, 1 dk için.</li>
	<li>Seti üreticisi tarafından sağlanan genel protokol uygun RNA arıtma PCR için sonraki adımları izleyin. Not: RNA ayıklandıktan sonra PCR standart protokoller kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-mimetic+3d+culture+platforms+allow+investigation+of+cooperative+effects+of+extracellular+matrix+features+on+therapeutic+resistance+in+glioblastoma.">Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma.</a> Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).</li><li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+the+terminator.">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBTRUS+statistical+report:+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2006+-+2010.">CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010.</a> Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).</li><li>Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microregional+extracellular+matrix+heterogeneity+in+brain+modulates+glioma+cell+invasion.">Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).</li><li>Zamecnik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+space+and+matrix+of+gliomas.">The extracellular space and matrix of gliomas.</a> Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).</li><li>Jadin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+expression+in+primary+and+secondary+brain+tumors.">Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors.</a> Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).</li><li>Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hyaluronan+in+glioma+invasion.">Role of hyaluronan in glioma invasion.</a> Cell adhesion &amp; migration. 2 (3), 202-207 (2008).</li><li>Pedron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+graded+hydrogels+for+preclinical+testing+of+glioblastoma+anticancer+therapeutics.">Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics.</a> MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).</li><li>Jiglaire, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+cultures+of+glioblastoma+in+three-dimensional+hydrogel+maintain+the+original+tumor+growth+behavior+and+are+suitable+for+preclinical+drug+and+radiation+sensitivity+screening.">Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening.</a> Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).</li><li>Florczyk, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+chitosan-hyaluronic+acid+scaffolds+as+a+mimic+of+glioblastoma+microenvironment+ECM.">Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM.</a> Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).</li><li>Day, A. J., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan-binding+proteins:+tying+up+the+giant.">Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).</li><li>Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+interferon+and+anti-CD44+antibody+on+mouse+glioma+invasiveness+in+vitro.">The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro.</a> Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).</li><li>Gilg, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hyaluronan+interactions+in+malignant+gliomas+and+their+drug-resistant+multipotent+progenitors.">Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors.</a> Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).</li><li>Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+hyaluronan+and+its+receptors+(CD44,+RHAMM)+regulate+the+activities+of+inflammation+and+cancer.">Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer.</a> Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).</li><li>Varga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+invasion-related+extracellular+matrix+molecules+in+human+glioblastoma+versus+intracerebral+lung+adenocarcinoma+metastasis.">Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis.</a> Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).</li><li>Guo, W., Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+during+tumour+progression.">Integrin signalling during tumour progression.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).</li><li>Bello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;v&#946;3+and+&#945;v&#946;5+integrin+expression+in+glioma+periphery.">&#945;v&#946;3 and &#945;v&#946;5 integrin expression in glioma periphery.</a> Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).</li><li>Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+treatment+for+glioblastoma:+integrin+inhibition.">A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition.</a> Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).</li><li>Chopra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+integrin-mediated+mechanotransduction+by+hyaluronic+acid.">Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).</li><li>Kim, Y., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44-mediated+adhesion+to+hyaluronic+acid+contributes+to+mechanosensing+and+invasive+motility.">CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility.</a> Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+orthotopic+glioblastoma+xenograft+models+recapitulate+the+histopathology+and+biology+of+human+glioblastomas+in+situ.">Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ.</a> Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).</li><li>Oh, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+validation+of+personalized+treatment+strategy+based+on+genetic+characteristics+of+glioblastoma.">Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma.</a> PloS one. 9 (8), e103327 (2014).</li><li>Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glioma+cell+phenotype+in+3D+matrices+by+hyaluronic+acid.">Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).</li><li>Wang, C., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+3D+brain+tumor+model+to+elucidate+the+effects+of+matrix+stiffness+on+glioblastoma+cell+behavior+using+PEG-based+hydrogels.">Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels.</a> Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).</li><li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+modification+of+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+for+tissue+engineering.">Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).</li><li>Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+fragments:+an+information-rich+system.">Hyaluronan fragments: an information-rich system.</a> European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).</li><li>Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ellman's+reagent:+5,+5&#8242;-dithiobis+(2-nitrobenzoic+acid)-a+reexamination.">Ellman's reagent: 5, 5&#8242;-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination.</a> Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).</li><li>Jin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+hyaluronic+acid-poly+(ethylene+glycol)+hydrogels+via+Michael+addition:+An+injectable+biomaterial+for+cartilage+repair.">Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair.</a> Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging.">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu 3D kültür sistemi kullanarak tekrarlanabilir veri nesil gerektirir: 1) tutarlı toplu iş toplu iş thiolation ha, verimli hidrojel öncüleri karıştırma ve hidrojel işleme elde etmek için pratik 2) zarar önlemek için kültürler ve optimize edilmiş 3) tohum kullanılan her hücre kültürünü yoğunluğu.
HA belirli ağırlık yüzdesi hidrojel istendiğinde, crosslink yoğunluk thiolation ha derecesini belirler. Toplu iş toplu iş değişim en aza indirmek için HA her thiolat...

Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri yerli dokularda onların iki boyutlu (2D) karşılıkları1,2daha iyi hücreleri ve onların çevreleyen hücre dışı matriks (ECM) arasındaki etkileşimler özetlemek. Doku mühendisliği gelişmeler yeni 1) nasıl kimyasal ve fiziksel bileşenleri kontrollü soruşturmalar matris microenvironment etkileyen hücre davranışları ve 2) etkinliğini sağlayan gelişmiş, 3D kültür platformlar vermiştir terapötik hastalıkları, kanserler2de dahil olmak üzere bir dizi için stratejiler. Vitro modelleri sinyalleri, endokrin ve bağışıklık gibi sistemik faktörler sorumlu olamadığınız ve böylece tamamen vivo içinde modelleri yerini alamaz iken, tekrarlanabilirlik, deneysel kontrol dahil olmak üzere çeşitli avantajları sağladıkları, uygun fiyatta ve hız. Burada, beyin mimetic hydrogels hangi 3D kültürler hasta kaynaklı Beyin tümör hücrelerinin tümör fizyolojisi, özellikle, tedavi direnç3edinme dinamikleri, bir çok yönünü yakalamak nasıl kullanılacağını açıklar. Diğer vitro yöntemlerine göre bu kültürler daha iyi vivo içinde tümör modelleri ve klinik gözlemler3temsil eder.
Glioblastoma (GBM) sadece 1-2 yıl4,5medyan sağkalım ile beyin kaynaklanan en sık ve öldürücü kanser olduğunu. Son yıllarda, birçok çalışma tümör matris çevre GBM6,7,8etkisi üzerinde odaklanmıştır. Benzersiz beyin ECM GBM hücre göç, yayılmasını önleme ve tedavi direnci6,7,8,9,10,11 etkiler bildirilmiştir , 12. hyaluronik asit (HA) nerede diğer GAGs ile etkileşim ve proteoglikanlar forma hidrojel benzeri bir kafes13beyin içinde bir bol glikozaminoglikan (GAG) olduğunu. Birçok çalışma GBM tümörler HA overexpression ve sonraki etkileri kanser ilerleme8,9,13,14,15,16 bildirdin ,17. Diğer ECM bileşenleri de GBM tümör büyüme ve işgal6,7,15,18etkiler. Örneğin, genellikle GBM içinde overexpressed, fibronektin ve vitronectin, heterodimerization hücre yüzey integrin reseptörlerinin bağlama "RGD" diziye aracılığıyla teşvik ve tümör hayatta kalma19 teşvik karmaşık sinyalleşme cascades başlatmak ,20,21. Biyokimyasal etkileri yanı sıra doku matris fiziksel özellikleri de GBM ilerleme22,23etkiler.
Sürekli terapiler direnç GBM ölümcül4ana sürücülerden biri değil. 2D veya gliomasphere modellerinde umut verici sonuçlar uyuşturucu sonraki hayvan çalışmaları ve klinik durumlarda3microenvironmental faktörlerin etkileri önemli ölçüde GBM tümör yanıt1olarak katkıda gösteren, başarısız oldu. Hayvan modelleri 3D sağlarken, fizyolojik microenvironment xenografted hasta hücrelere uygun ve klinik sonuçları24,25, beyin microenvironment in vivo karmaşıklığı oluşturmak Bu hücre-matris arasındaki etkileşimleri dahil olmak üzere özellikleri, belirli anahtar biyolojik sonuçları olduğunu belirlemek için zor yapar. Yeni tedavi hedefleri tanımlaması Biyokimya ve biyofizik özelliklerini tanımlandığı Basitleştirilmiş kültür platformlar kullanımından yararlanacaktır.
GBM tümör microenvironment26,27 daha önce bildirilen biomaterial modellerinin hangi özelliklerini tek tek fiziksel ve biyokimyasal ECM, biomaterial platformu üzerinde doğru dik kontrol elde değil GBM hücre fenotip birden çok bağımsız özellikleri katkıların bildirilen burada etkinleştirir ayırımı. Burada, hasta kaynaklı GBM hücre 3D kültür için bir HA tabanlı, uygun tunable hidrojel sistemi mevcut. Hydrogels iki polimer bileşenlerinden oluşan: 1) biyolojik olarak aktif HA ve 2) biyolojik olarak inert Polietilen glikol (PEG). PEG düşük protein adsorpsiyon ve en az immünojenisite28ile bulunan yaygın olarak kullanılan biyouyumlu ve hidrofil malzemesidir. Burada, HA ile zincir glucuronic asit moieties yaklaşık % 5'i thiol gruplarla crosslinking bir piyasada bulunan 4-kol-maleimides yolu ile Michael-türü ek ile sona PEG için etkinleştirmek için functionalized. Vücuttaki en genel haliyle, HA yüksek molekül ağırlıklı (HMW) zincirler içinde bulunmaktadır. Burada, düşük derece HMW HA (500-750 kDa) değişiklik HA ve CD4429dahil olmak üzere onun hücre reseptörleri yerli etkileşimler korumak için yardımcı olur. PEG-thiol HA-thiol için toplam thiols maleimides için bir sabit molar oranını koruyarak yerine kullanarak, HA konsantrasyonu elde edilen hydrogels mekanik özelliklerinden decoupled. Ayrıca, her 4-kol-PEG maleimide sonlandırılmış kollarda Ortalama sayıda peptidler sistein sonlandırılmış çekimlerine stokiometrik denetimleri kullanılabilir. ECM kaynaklı, yapışkanlı peptidler birleşmesiyle integrinler kültürlü hücrelerde, hangi aracılığıyla kimyasal ve biyokimyasal transduced1sinyaller ile etkileşim sağlar. Maleimide-thiol yanı sıra çok hızlı bir şekilde hücre saklama ve hasta elde edilen hücre maximizing hayatta kalmak için gereken süreyi en aza indirerek fizyolojik koşullar altında gerçekleşir. Ayrıca, hidrojel kültürler tipik doku örneği gibi tedavi edilebilir ve Western blot, akış sitometresi ve ayirt boyama gibi standart karakterizasyonu teknikleri ile uyumlu değildir. Aşağıdaki iletişim kuralı hydrogels, 3D kültürleri hasta kaynaklı GBM hücreleri ve biyokimyasal analiz teknikleri kurulması imalatı için yordamlar açıklanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2204px;" width="2203">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pH meter</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:1579px;">Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Stir plate</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>General lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Erlenmeyer flask (125mL)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">FB-501-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dialysis tubes</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">21-152-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">2L polypropylene beaker</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">S01916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">sodium hyaluronan</td>
			<td style="width:136px;">Lifecore</td>
			<td style="width:121px;">HA700k-5</td>
			<td>500-750 kDa range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">PI-22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td style="width:136px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:121px;">130672-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">SA48-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cystamine dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">AC111770250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">BP172-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:368px;">Ellman&#39;s test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">D218200-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Deuterated water (deuterium oxide)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">AC166301000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">0.22&#181;m vacuum driven filter</td>
			<td style="width:136px;">CellTreat</td>
			<td style="width:121px;">229706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Hanks&#39; balanced salt saline (HBSS)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">MT-21-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">4-arm-PEG-maleimide</td>
			<td style="width:136px;">JenKem Technology</td>
			<td style="width:121px;">A7029-1</td>
			<td>molecular weight around 20kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">4-arm-PEG-thiol</td>
			<td style="width:136px;">JenKem Technology</td>
			<td style="width:121px;">A7039-1</td>
			<td>molecular weight around 20kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">L-Cysteine&#160;</td>
			<td style="width:136px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:121px;">C7880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RGD ECM mimetic peptide</td>
			<td style="width:136px;">Genscript Biotech</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Custom peptide with sequence &#34;GCGYGRGDSPG&#34;, N-terminal should be acetylated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">silicone molds</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">GBL664201-25EA</td>
			<td>Use razor blade to cut into single pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">complete culture medium</td>
			<td style="width:136px;">Various</td>
			<td style="width:121px;">Various</td>
			<td>DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25&#181;g/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">patient derived GBM cell</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">20G needle</td>
			<td style="width:136px;">BD medical</td>
			<td style="width:121px;">305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">1mL syringe</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">10mL syringe</td>
			<td style="width:136px;">BD medical</td>
			<td style="width:121px;">302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">PI-89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">protease/phosphatase inhibitor mini tablet</td>
			<td style="width:136px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:121px;">5892970001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">vortex shaker</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">12-814-5Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">70&#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">AC416785000</td>
			<td>Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">D-sucrose</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">NC9373881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Any General One with 5% CO2 and 37C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">fridge/freezer</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Disposable embedding molds</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Lyapholizer</td>
			<td style="width:136px;">Labconco</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Any -105C freeze dryers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">HEPES</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Amber vial</td>
			<td style="width:136px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:121px;">60912D-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Wide orifice pipette tips</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">9405120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">2-methylbutane</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">03551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells

Glioblastoma (GBM) en yaygın henüz en ölümcül, merkezi sinir sistemi kanseri de öyle. Son yıllarda, birçok çalışma nasıl benzersiz beyin çevre, hyaluronik asit (HA), gibi hücre dışı matriks (ECM) GBM ilerleme ve işgal kolaylaştırır üzerinde odaklanmıştır. Ancak, çoğu vitro kültür modelleri dışında bir ECM kapsamında GBM hücre içerir. GBM hücre fare xenografts de yaygın olarak kullanılır. Ancak, in vivo modelleri karmaşık tümör microenvironment tümör davranış özelliklerini tek tek katkılarıyla ayırmak zor hale. Burada, araştırmacılar bağımsız olarak HA konsantrasyon ve sertliği değiştirmek sağlar bir HA hidrojel tabanlı, üç boyutlu (3D) kültür platformu açıklayın. Yüksek molekül ağırlıklı HA ve Polietilen glikol (PEG) çapraz Michael-türü ek huzurunda canlı hücreleri ile olan hydrogels oluştururlar. Hasta kaynaklı GBM hücreleri sergi canlılığı ve nükleer silahların yayılmasına karşı 3D hidrojel kültürleri oranları kadar iyi, ya da standart olarak gliomaspheres kültürlü zaman daha iyi. Hidrojel sistem ayrıca belirli hücre-ECM etkileşimleri etkileri yalıtmak için ECM mimetic peptidler birleşmesiyle sağlar. Böylece canlı hücreleri 3D kültüründe görüntüsü Hydrogels optik saydamdır. Son olarak, HA hidrojel kültürler moleküler ve hücresel analizleri, PCR, Western blot ve ayirt boyama tarafından takip cryosectioning gibi standart teknikleri ile uyumludur.

1H -NMR veya bir Ellman'ın testi kullanarak thiolated HA her toplu işlem için thiolation derecesini doğrulanması gerekir. HA burada sürekli olarak açıklanan yordamı kullanarak değişiklik (thiols HA disakkarit için molar oranı olarak tanımlanır) ~ %5 thiolation oluşturur (Şekil 1).
Bu yeni kültür platformu kurma büyük ölçekli deneyler uygulamak önce...

Watch this Scientific Journal Video about Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells at JoVE.com

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Burada, üç boyutlu kültür glioblastoma hasta elde edilen hücre içinde uygun tunable Biyomalzeme beyin matris taklit etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir vitro, in vivo glioblastoma hücre kültüründe genellikle kayıp birçok özelliklerini korur deneysel platformu sağlar.

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

hyaluronic-acid-based-hydrogels-for-3-dimensional-culture-patient

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.9K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Burada, üç boyutlu kültür glioblastoma hasta elde edilen hücre içinde uygun tunable Biyomalzeme beyin matris taklit etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir vitro, in vivo glioblastoma hücre kültüründe genellikle kayıp birçok özelliklerini korur deneysel platformu sağlar.

Video: Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Biyomühendislik

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Proteolitik Degradable 3 Boyutlu Sistem Yumurtalık Folikül Encapsulation ve Kültür Bir Yöntem

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...