Bu yöntem, araştırmacıların matris ipuçlarının 3D kültürdeki hücrelerin fenotipini nasıl etkilediğini sistematik olarak araştırmalarını sağlar. GBM hücrelerinin kültürlerini kullanarak prosedürü gösteriyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, birçok matris koşulunu taramamızı sağlayan yüksek verimli uygulamadır.
Bu teknik, tümör hücrelerinin ilaç direnci gibi hücre kültürü modellerinde spesifik fonksiyonları koruyan doku-mimetik matrisler geliştirmek ve potansiyel olarak yeni terapötikleri tanımlamak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Mary Epperson ve Kelly Tamura, Seidlits Lab'den lisans araştırmacıları. HEPES tozunu Hanks dengeli tuz çözeltisinde 20 milimolar'da çözerek HEPES-tamponlu çözelti hazırlamaya başlayın.
Tam sorbasyonun ardından pH'ı yediye ayarlayın. HEPES-tamponlu çözeltide, tiyollenmiş HA'yı çözün, böylece her glukuronik asit üzerindeki karboksilik asit kalıntılarının% 6 ila% 8'i, tampon çözeltisinde mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda bir tiol ile modifiye edilir. Tamamen çözünene kadar, tipik olarak yaklaşık 45 dakika oda sıcaklığında manyetik bir karıştırma plakası kullanarak dakikada 1.000'den az dönüşte karıştırın.
HA çözünürken, mililitre başına 100 miligram 8kollu PEG norbornen, mililitre başına 100 miligram 4kollu PEG tiol, dört milimolar sistein veya sistein içeren peptit ve mikrosantrifüj tüplerinde mililitre LAP başına dört miligram ayrı çözeltiler hazırlayın. Bu noktada tek bir hidrojel içine bağlanacak tüm peptitlerin dört milimolar çözeltilerini hazırlayın. Son hidrojel matrisleri için nihai konsantrasyonları elde etmek için HA, PEG norbornen, PEG tiol ve sistein-tiol içeren peptitlerin bireysel çözeltilerini karıştırın.
Tamamen karıştırmak için manyetik bir merdiven plakası üzerinde dakikada 1.000'den az dönüşle en az 30 dakika karıştırın. Numuneleri aydınlatma cihazıyla, silikon kalıpların veya 384 delikli plakanın tek bir sütunundaki diğer tüm LED'lerle hizalayın. UV LED Parametrelerini açın ve yoğunluk ve aydınlatma değerlerini girin.
Ardından aydınlatmaya başlamak için Son'a tıklayın. Aydınlatmayı takiben, bir köşeye yerleştirildiğinde, kuyu plakasını bir sonraki köşeye taşıyın ve tekrarlayın. Plakanın diğer yarısındaki kuyucukları aydınlatmak için, plakayı tutucudan kaldırın ve 180 derece döndürün.
Farklı mekaniklere sahip hidrojeller üretmek için, cam slaytları ve silikon kalıpları temizlemek için bant kullanarak temizlemekle başlayın. Silikon kalıpları cam kızağa yapıştırın, iyi bir sızdırmazlık sağlamak için aşağı bastırın ve hava kabarcıklarının yerini alın. Daha sonra, cam slayt üzerindeki her silikon kalıba 80 mikrolitre hidrojel öncü çözeltisi pipet.
Cam kaydırağı, tek bir sütundaki diğer tüm LED'lerle hizalanmış aydınlatma cihazına yerleştirin. Çapraz bağlantıyı fotoğraflamak için hidrojel öncüllerini 15 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Aydınlatma durduktan sonra, slaytları alın ve kalıbın iç çevresini ince bir uçla izleyerek jelleri kalıplardan gevşetin.
Silikon kalıpları cımbız veya forseps ile çıkarın. 12 delikli bir plakayı iki mililitre DPBS ile doldurun. Çapraz bağlı hidrojelleri, bir spatulayı ıslatarak ve yavaşça cam slayttan iterek ayrı bir kuyu plakasına taşıyın.
İstenilen hücreleri tek hücreli bir çözelti olarak hazırlayın. Yaklaşık 150 mikrometre çapındaki glioblastoma sferoidlerini, bir T-75 şişe süspansiyon kültüründen 15 mililitrelik bir konik tüpe toplayın. Artık hücreleri ve ortamları çıkarmak için kültür şişesini beş mililitre DPBS ile durulayın ve bu hacmi konik tüpe ekleyin.
Hücreleri içeren konik tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı beş mililitrelik bir serolojik pipetle çıkarın, hücre peletini rahatsız etmemeye ve beş mililitre DPBS'de yeniden askıya almaya dikkat edin. Hücreleri yıkamak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın.
Süpernatantı beş mililitrelik bir serolojik pipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin ve ardından hücreleri iki mililitre hücre ayrışma reaktifinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın. Üç mililitre tam orta ve nazikçe pipet ekleyerek sferoidleri tek hücreli bir süspansiyona parçalayın.
Tek hücreli süspansiyonu 400 kez G'de beş dakika boyunca santrifüjle hücrelere oda sıcaklığında pelet haline getirin. Süpernatantı beş mililitrelik bir serolojik pipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücreleri bir mililitre tam ortamda yeniden askıya alın.
Bir hemositometre kullanarak saymak için hücrelerin bir kısmını çıkarın. Bu kısmı, canlılığı tehlikeye giren hücrelere nüfuz eden tripan mavisi ile iki kat seyreltin. Sadece canlı, renksiz hücreleri sayın.
Kapsülleme için gerekli hücre sayısını belirleyin. Gerekli toplam hücre sayısını içeren bir ortam hacmini steril 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 kez G'de döndürün.
Süpernatantı bir mikropipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücre peletini hidrojel öncü çözeltisinde yeniden askıya alın, 1.000 mikrolitrelik bir mikropipetle dört ila beş kez yukarı ve aşağı pipetle iyice karıştırın. Hücreleri, 10 mikrolitre dağıtmak üzere ayarlanmış bir tekrar pipetleyiciye yükleyin.
Kabarcıkları ve düzensiz dağıtımı önlemek için, bir atık kabına bir ila iki kez daha dağıtarak tekrarlanan pipetleyiciyi hazırlayın. 384 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda, tekrarlanan pipetleyiciden hidrojel çözeltisinde asılı 10 mikrolitre hücre dağıtın. LED dizisini kullanarak, istenen mekanik özellikleri elde etmek için hücreyi içeren her kuyuyu 15 saniye boyunca aydınlatın.
Hücreleri içeren her bir kuyucuğa 40 mikrolitre tam ortam ekleyin. Buharlaşmadan kaynaklanan kayıpları en aza indirmek için jelleri çevreleyen deneysel olmayan kuru kuyucuklara 50 mikrolitre DPBS ekleyin. Glioblastoma hücreleri için, kapsüllemeden üç gün sonra başlayarak, istenen son konsantrasyonu elde etmek için ortam içeren ilacın 40 mikrolitresini ekleyin.
Hücreleri içeren her bir kuyucuğa 10 mikrolitre CCK8 reaktifi ekleyin. Üreticinin talimatlarına göre bir ila dört saat boyunca kuluçkaya yatırın. Kuluçkayı takiben tüm kuyular için 450 nanometrede absorbansları okuyun.
Tek hidrojellerin yüzeylerindeki mikron ölçekli bölgelerin AFM sorgulaması, daha yumuşak ortalama Young modülüne sahip hidrojellerin de daha sert hidrojellerden daha küçük modül aralıklarına sahip olduğunu göstermiştir. Mililitre başına 2.500.000 hücre yoğunluğunda tohumlanan GS122 hücrelerinin 3D kültürleri, kültürde yedi gün sonra değerlendirildiğinde, mililitre başına 500.000 hücre yoğunluğunda tohumlananlara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek canlılıklar sergilemiştir. GS122 hücreleri, osteopontin türevi peptitler matrise dahil edildiğinde sekiz kilopaskal durumda hayatta kalma kazanımları gösterirken, integrin bağlayıcı sialoprotein veya tenasin C türevi peptitlerin dahil edilmesi, zencefil RGD peptidi ile kültür ve matrisler gibi minimal sağkalım yararları sağlamıştır.
Buna karşılık, hiçbir peptit 0.8 kilopaskal kültür koşulunda hayatta kalma kazanımları sağlamadı. Hem GS122 hem de GS304 hücreleri, RGD içeren peptitler de dahil olmak üzere yumuşak veya sert hidrojel matrislerinde kültürlendiğinde yayılır. GS122 hücreleri, osteopontin ile hem 0.8 hem de 8 kilopaskallarda benzer bir yayılma eksikliği göstermektedir.
Bununla birlikte, GS122 sadece sekiz kilopascals durumunda temozolomide karşı gelişmiş direnç göstermiştir. Son olarak, bu minyatür 3D kültür platformu, ölümcül olarak farklılaşmış nöroendokrin prostat kanseri hücrelerinin canlı organoidleri de dahil olmak üzere diğer tümör tiplerinden insan hücrelerini kültürlemek için kullanılabilir. Bu prosedürü takiben, hücre fenotiplerini daha da karakterize etmek için tek hücreli RNA dizilimi gibi daha ileri teknikler kullanılabilir.
