Bu yöntem farelerde erken ateroskleroz patofizyolojisi anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, aldosteron yetişkin büyüme ateroskleroz plakları gelişimini neden olan verimlilik, hızlılık. Bazı teknik adımların yalnızca metin yönergesi yoluyla öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir.
Prosedürü gösteren Caterina Mammi, benim laboratuvar bir personel bilim adamı olacaktır. Cerrahi eldiven ler giyerek, mini pompa dolum tüpünü bir mililitreşile takın ve tüpü 125 mikrolitre aldosteron veya araç çözeltisi ile yükleyin. Daha fazla ilerleyene ve pompayı aldosteron çözeltisi ile yavaşça doldurana kadar dolgu tüpünü mini pompanın üst kısmındaki delikten takın.
Pompa gövdesinden sıvı bir boncuk yükseldiğinde pompayı doldurmayı bırakın ve dolum tüpünü dikkatlice çıkarın. Akış regülatörü mini pompanın gövdesine takın, regülatörün pompa gövdesine sıkıca bakılmasına dikkat edin ve dolgulu pompayı implantasyondan 24 saat öncesine kadar 37 santigrat derecede steril tuzlu çözelti içeren bir kabın içine asal olarak yerleştirin. Pompaları yerleştirmek için, kılları cerrahi bölgeden çıkarmak için bir jilet kullanın ve maruz kalan cildi %70'i iopropil alkolle dezenfekte edin, dokuma sızma ped malzemesi.
Daha sonra, deri yoluyla 0.8-bir santimetre lik bir kesi yapın, ancak altta yatan dokuları değil ve kesiyi açmak için çerseps kullanın. Diğer taraftan bir trokar kullanarak, skapula doğru kesi pompa için bir cep oluşturmak için deri yayıldı ve kesi içine pompa eklemek, regülatör başı farenin önüne doğru yönelik, yavaşça pompa tamamen cebine iterek böylece gerginlik veya germe olmadan yara kapatmak için yeterli deri var. Pompa takıldıktan sonra, ameliyat teli ile kesi dikiş ve topikal uygulamak için temiz bir bez kullanın, 10%povidone iyot merhem.
Sonra fare tam recumbency kadar izleme ile bir ısınma aşamasında kurtarmak için izin verin. Uygun deneysel bitiş noktasında, 10 ila 15 mililitre buz gibi soğuk DPBS ile yerçekimi perfüzyonu kullanarak sol ventrikül üzerinden fare perfuse, nötr tamponlu formüllerin% 10 40 ila 50 mililitre izledi. 10 ila 20 dakika sonra fareyi stereo-mikroskop altına yerleştirin ve aşırı periaortik ve perikardiyal yağ dokusunu çıkarmak için perçeler ve makaslar kullanın.
Keçelerle sabit kalbi tutun ve aort kemerinin erişimine dik bir şekilde kesin, hasara yol açmadan kalbe mümkün olduğunca yakın. Kalp aort tan ayrıldıktan sonra, sağ ve sol atriyumun alt noktalarını birleştirerek düz bir çizgi boyunca enine kesmek için neşter kullanın ve açık kalbin üst kısmını optimum kesme sıcaklığı bileşiğiyle doldurun. Dikdörtgen kalıbın tabanına dik olarak yerleştirilen aort ekseni ile kriyo-kesitli plastik bir kalıp ile rezeke doku yerleştirin ve taze OCT ile doku kapağı.
Doku düzgün odaklı olduğundan emin olmak için kalıp Backlight, daha sonra dikkatle kuru buz üzerinde bir metal plaka üzerinde kalıp yerleştirin, eksi 80 derece Santigrat depolama için gümüş folyo ile tüm kalıbı sarma EKIM beyaz döndüğünde. Kriyo-stat eksi 20 santigrat dereceye ulaştığında, dondurulmuş kalp bloğunu dışa bakacak şekilde numune tutucuya monte edin ve numune tutucuyu numune nin yönlendirme kafasına takın. Numune tutucunun yönünü, aort kökü ile bıçağa dik olarak blok bölümüne ayarlayın ve aort köküne ulaşılıncaya kadar bloğu kesin.
Üç aort kapağı da ortaya çıkana kadar anatomik aort kök profilini izleyerek seri bölümleri cam slaytlar üzerine toplayın. Sonra altı ila sekiz, 10 mikrometre kalınlığında bölümleri toplamak ya da üç vana biri kaybolur veya artık bozulmamış kadar. Yağ kırmızı O nötr yağ boyama için, beş dakika için% 37 formaldehit 70 mililitre bölümleri düzeltmek, musluk suyunda iyice yıkama izledi.
2-3 dakika sonra, erişim suyu kapalı leke ve 10 dakika boyunca% 0.3 yağ kırmızı O 70 mililitre bölümleri leke. Kuluçka sonunda, 10 dakika musluk suyunda slaytlar yıkayın ve Meyer's hematoksilin 70 mililitre içinde bir dakika hücreleri leke, bir dakika su yıkama ve bir dakika emersion 0.5% lityum karbonat 70 mililitre. Daha sonra hücreleri son bir dakika suda yıkayın ve ışık mikroskobu ile görüntüleme için sulu bir montaj ortamı ile bölümleri monte.
Tedavi dört hafta sonra, apolipoprotein-E nakavt fareler lipid içeriğinde önemli bir artış gösterdi, kontrol-vahşi tip hayvanlara göre. Ayrıca, aldosteron tedavisi mack-3 boyama ile kanıtlanan ve araç tedavi farelere göre bu hayvanlarda daha iltihaplı aterosklerotik plak gösteren olarak nakavt hayvanlarda makrofaj içeriğini artırır. Ancak, aldosteron tedavisi aterosklerotik plakların kollajen içeriğini değiştirmez.
Bu prosedürü denerken, bu yöntemin sadece aterojenik boya ile beslendiğinde ateroskleroz geliştirmeye doğal yatkın olan apolipoprotein fareler için doğrulandığı unutulmaması önemlidir. Bu nedenle farklı hayvan modellerine uygulanamaz. Bu prosedürü takiben, diğer aort bölgesindeki aterosklerozun karakterize edilmesi ve aterosklerotik yükün toplamının ölçülmesi için infra-boyama gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.
Bu teknik, geliştirilmesinden sonra ateroskleroz alanında araştırmacıların inflamasyon ve endotel disfonksiyonu gibi aterogenezin erken mekanizmasını keşfetmelerinin önünü açmıştır. Isophane ve formalin gibi uçucu bileşiklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken güvenlik laboratuvarı yüz maskesi takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
