Protokolümüz, araştırmacıların benzer popülasyonların immünoresan boyama ile henotipik karakterizasyonunu gerçekleştirmek için standart deneysel boru hatları uygulamasına yardımcı olur. Bu teknikle araştırmacılar, karmaşık hastalık dokularının benzer bileşimini titizlikle analiz edebilir ve hücre tiplerinin fenotiplerinin nitel ve nicel analizlerini gerçekleştirebilirler. Prosedürü gösteren Sidney Mahan, laboratuvarımdan bir teknisyen.
Brakiyosefalik arter hasat için hayvan hazırlamak için, göğüs kadar periton kesti, karın dokularına zarar vermemeye özen. Ve orta aksiller çizgide göğüs kafesine iki kesik çıkararak kalbe ve akciğerlere zarar vermemeye özen gösteriyor. Sonra, kısmen kalp ortaya çıkarmak için diyafram kesti.
Fareyi kullanmak için, damar morfolojisinin tutarlı bir profüzyonu ve bakımına olanak sağlamak için, profüzyon sıvısının basıncının ortalama murin kan basıncına eşdeğer olduğu bir yerçekimi profüzyon sistemi kurun. Daha sonra, oda sıcaklığında beş mililitre PBS, 10 mililitre 4% oda sıcaklığında paraformaldehit ve oda sıcaklığında PBS beş ek mililitre ile hayvan bol. 23 veya 25 gauge kelebek iğneyi yerçekimi profüzyon sistemine bağlayın ve iğneyi sol ventriküle takmadan önce tüplerden havayı çıkarmak için PBS'yi iğneden geçirin.
İğneyi yerine emniyete aldıktan sonra, sağ atriyumda iki santimetreden az bir kesi yapmak için iris makas kullanın. Taze% 4 paraformaldehit içine ilgi dokuları Hasat. Brakiyosefalik arterortaya çıkarmak için, manubrium aracılığıyla sternum un orta hattı aşağı bir kesi yapmak için makas kullanın ve göğüs boşluğu tamamen açmak için göğüs kafesinin her iki tarafını çekmek için forseps kullanın.
Sonra, kısmen karotidler görselleştirmek için bir diseksiyon mikroskobu altında hayvan yerleştirin, ve sağ karotis kadar kasları çekmek için ince cımbız kullanın, bağ dokusu, ve yağ, brakiyosefalik arter, subklavian bifurasyon, ve aort kemer temizlenir ve çevreleyen bağ dokusu ve yağ izole edilir. Daha sonra, çatallanma nın altında doğru karotis kapmak ve forceps üzerinde bir ilk kesim yapmak için forceps kullanın. Yine de, karotis tutarak, subklavian arter ile ikinci bir kesim yapmak ve brakiyosefalik arter her iki tarafında aort kemer ile son iki kesim yapmak.
Daha sonra, ilgi diğer vasküler dokular toplamak ve oda sıcaklığında bir gecede% 4 paraformaldehit çözeltisi brakiyosefalik arter ve diğer dokuları yerleştirin. Brakiyosefalik arterin immünofloresan boyama için, aort kemerinin kesitli olduğu ve brakiyosefalik arterin görülebildiği ışık mikroskobu yla doğrulanana kadar parafin gömülü doku örneğinden 10 mikrometre kesit elde etmek için bir mikrotom kullanın. Doku mikrotom bıçağına tamamen dik olana kadar bloğun yönünü ayarlayın ve subklavian bifurkasyona ulaşılıncaya kadar cam kaydırak başına brakiyosefalik arterin üç seri 10 mikrometre kalınlığında kesiti elde edin.
Tüm bölümler toplandığında, doku örneklerini kimyasal başlık altında iki beş dakikalık ksilen daldırma, ardından belirtildiği gibi beş dakikalık daldırma etanol serisi ve iki beş dakikalık deiyonize su daldırma ile nemlendirin. Daha sonra, antijen alma çözeltisi içinde inkübasyslaytlar, standart protokollere göre, 20 dakika mikrodalga ısıtma izledi. Oda sıcaklığında bir saat soğuduktan sonra, her doku bölümünü çevrelemek için hidrofobik bir kalem kullanın.
Ve oda sıcaklığında bir saat boyunca tampon engelleme ile herhangi bir non-spesifik bağlama engelleyin. Kuluçka sonunda, doku örneklerini bir gecede dört santigrat dereceye, birincil antikor kokteyli veya izotip igG kontrol antikorlarıyla eşleştirin. Ertesi sabah, yıkama başına beş dakika PBS üç kez slaytlar yıkayın, çekirdek görüntüleme için uygun floresan konjuge ikincil antikor kokteyl ve DAPI bir saat kuluçka izledi.
Daha sonra, floresan mikroskopi için uygun montaj ortamı slaytlar üzerine kapakları monte etmek için kullanın. Etiketli doku bölümlerinin konfokal mikroskopi görüntülemesi için, dedektörün hassasiyetini, lazer gücünü ve her bir kanal için ofsetini ayarlamak için IgG kontrolü ve primer antikorlarla boyanmış bölümleri kullanın. Ardından, z yığını edinimi için üst ve alt konumları ayarlayın ve görüntülenecek yığınların kalınlığını ve sayısını belirleyin.
Tüm görüntüler elde edildiğinde, ImageJ'deki görüntüleri açın ve kanal araçları panelini açın ve farklı boyama kanallarını renklendirin. Renk kanallarını birleştirin. Tüm kanallar aynı görüntüüzerinde görünür hale gelmelidir.
Kanal araçları paneli içinde tek tek renk kanallarını açıp kapatın ve çok noktalı aracı seçmek için sayma simgesine sağ tıklayın. Nokta araç panelini açmak ve hücreleri saymak için kullanılan öğelerin türünü ve boyutunu seçmek için sayım simgesine çift tıklayın. Tümünü göster'i denetleyin ve yalnızca kanal araçları panelinde DAPI kanalını açın.
Ardından, karşı kanal sıfır'ı seçin ve etiketlenecek tek tek çekirdeklere tıklayın, z-yığınları arasında ilerleyerek ilgi alanı içinde lekelenmiş tüm çekirdekleri sayın. Sayısallaştırılmış tek hücreli olayların sayısı nokta araç panelinde aşağıda belirtilecektir. Tüm çekirdekler etiketlendiğinde, başka bir boyama kanalını açın ve DAPI ile antikor boyama arasında kolokalizasyon olduğu hücreleri etiketlemek için karşı kanal birini seçin.
Sitoplazmik boyama için, çekirdeğin tüm derinliği boyunca çekirdeği çevreleyen boyama ile hücreleri seçin, gerektiğinde birden fazla z-yığınları kontrol. Sonuçlar daha sonra DAPI pozitif hücrelerin toplam sayısı, ya da ilgi bölgesi içinde alan başına hücre sayısı hücre sayısı olarak ifade edilebilir. İmmünfloresan boyama, fenotipik belirteçleri hedef leyen antikorlarla, tek hücre sayımı için ilgi alanlarının tasviri için her bir marker boyama ve diferansiyel girişim kontrastının elde edilmesine olanak sağlar.
Farklı düz kas hücre kaynaklı popülasyonların bolluğunu belirlemek için tek hücre sayma daha sonra ImageJ kullanılarak yapılabilir. Örneğin, bu temsili kesitlerin fibröz kapak bölgesinde tek hücre sayma analizi, igG kontrolüile eşleşen izotip ile tedavi edilen anti IL-1 beta antikor ile tedavi edilen fareler ile fibröz kapak alanının hücresel bileşiminde dikkate değer farklılıklar ortaya koymuştur. Nitekim, IL-1 beta inhibisyonu YFP-pozitif düz kas hücrelerinde bir azalma ile ilişkili, ve galektin-3-pozitif hücrelerde bir artış.
Ayrıca YFP-pozitif düz kas aort alfa aktin-pozitif düz kas hücrelerinin sayısında azalma gözlendi. Düz kas hücre kaynaklı YFP-pozitif galektin-3-pozitif makrofajların göreceli sayısı ise her iki brakiyosefalik arter lokasyonunda anlamlı olarak artmıştır. Özellikle, IL-1 beta inhibisyonu lezyon içinde osteokondrojenik hücrelerin toplam sayısını etkilemedi, ya da düz kas hücre kaynaklı veya makrofaj kaynaklı kondrojenik hücrelerin oranı.
Bu protokol, doku toplama, işleme ve kesit gibi önemli adımların yanı sıra tek hücre sayma gibi önemli adımları standartlaştırarak aterosklerotik lezyon analizinde katılığı ve tekrarlanabilirliği artırmak için tasarlanmıştır. Bu protokol, aort ve aort kökü de dahil olmak üzere aterosklerotik lezyonların sunulması için eğilimli ek vasküler yatakları analiz etmek için kullanılabilir.
