Kardiyak progenitor hücrelerinin veya TBM'lerin amplifikasyon üzerine farklılaşması, çoğalan bir aşamadan kararlı bir aşamaya doğru bir faz geçişi gerektirir ve bu protokol CpC'lerde verimli endotel soyu kullanır. Tekniğin en büyük avantajı, çeşitli tekniklere ve farklı türlerden izole edilmiş KBM'ler için geçerli olmasıdır. Bu protokol hücre tedavisi için CpCs terapötik potansiyelini artırmak için kullanılabilir.
Ayrıca, farklılaşmanın potansiyellerini ve mekanizmalarını ve bunların kalp hastalığından nasıl etkilendiğini araştırmak için de kullanılabilir. CpC'ler şekil, boyut ve potens açısından farklılık gösteren homojen bir hücre popülasyonudur. Bu nedenle, protokol kullanılan CpCs belirli alt nüfusa göre ayarlanmalıdır.
Fareyi anestezi ettikten sonra göğsünü %70 etanol ile silin. Makas kullanarak, torasik boşluğu ortaya çıkarmak için deri ve göğüs duvarı kesti. Kalbi kaldırmak için forseps kullanın ve sonra tabanında kesmek için makas kullanın.
Kalbi beş mililitre soğuk PBS içeren bir P60 kültür yemeğine aktarın ve sonra kalbi pompalamak ve kanı boşluklardan çıkarmak için çerofma kullanın. Kalbi beş mililitre soğuk PBS içeren bir P60 kabına yerleştirin ve yıkayın. Atria kaldırmak için küçük makas kullanın, iki uzunlamasına parçalar halinde kalp kesmek, ve buz soğuk PBS beş mililitre onları yıkayın.
Küçük makas kullanarak, daha küçük bölümlerhalinde kalp parçaları kesti. Mililitre başına bir miligram konsantrasyonda kollajenaz B içeren hank dengeli tuz çözeltisi bir damla ekleyin ve iyice küçük kalp parçaları kıyma için steril bir jilet kullanın. Sonra, çanak kollajenaz B çözeltisi 2,5 mililitre ekleyin.
37 derece santigrat bir kuvöz de 30 derecelik bir açıyla çanak yerleştirin. Kuluçka sırasında her 10 dakikada bir Pasteur pipetinden geçerken, kıyılmış kalp parçalarının en fazla 30 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. İlk olarak, kıyılmış ve homojenize kalp parçaları% 2 FBS ile desteklenen soğuk HBSS beş mililitre ekleyin.
100 mikrometrefiltre kullanarak, sindirilmemiş doku kaldırmak için kalp parçaları filtre. Santrifüj 470 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Supernatant atın ve kırmızı kan hücresi lisis tampon beş mililitre pelet yeniden askıya.
Ara sıra sallayarak beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. Bundan sonra, 10 mililitre PBS ekleyin ve artık kardiyomiyositler de dahil olmak üzere daha büyük hücreleri dışlamak için numuneyi 40 mikrometrelik bir filtreden filtreleyin. 470 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika ara vermeden santrifüj.
Daha sonra, dmem hücreleri yeniden askıya 10% FBS ile desteklenmektedir, mililitre başına bir milyon hücrenin son hücre konsantrasyonu amaçlayan. Hücreleri boyama ve sıralama için iki tüpe dağıtın, bir tüpe hücre çözeltisinin 1,5 mililitresini ve ikinci tüpe 3,5 mililitre ekleyerek. Hoechst çözeltisi ekleyin ve boya eşit dağıtmak sağlamak ve hücrelerin pıhtılaşmasını önlemek için ara sıra çevirme ile 90 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.
Yan popülasyon ana nüfusun dışında Hoechst düşük alt sol köşesinde görünür. FACS arsa içinde verapamil ortadan kaybolmak için yan nüfus ister negatif kontrol dayalı tespit edilebilir. Orta 1 ila 37 santigrat derece ısıtın ve santrifüjü 4 santigrat dereceye kadar soğutun.
Sıralama tüplerini 470 kez G'de ve dört santigrat derecede altı dakika santrifüj edin. Daha sonra, orta bir hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri, dört mililitre orta litre içeren gaz geçirilebilir bir P60 kabına aktarın.
Hücreler her şişede orta bir sekiz mililitre kullanarak T75 şişelerinde iki ila üç gün boyunca hücreler 70 ve %80 Kültür SP-CpC'leri arasında bir araya gelene kadar her üç günde bir ortamı değiştirin. Daha sonra, dikkatle orta aspire ve yavaşça sıcak HBSS beş mililitre ile şişe durulayın. Hücreleri 5 mililitre tripsin EDTA ile %5 karbondioksit le 37 santigrat derecede beş dakika tedavi edin.
Daha sonra, tripsin aktivitesini durdurmak için orta bir beş mililitre ekleyin ve 15 mililitrelik bir tüp hücre süspansiyon aktarın. Oda sıcaklığında beş dakika 470 kez G santrifüj. Ardından, orta bir veya orta iki deki hücreleri yeniden askıya alın.
P60 tabaklarda hücreleri kaplayın, tabak başına 250, 000 SP-CPC'yi farklı serum konsantrasyonları içeren üç mililitre lik orta ile kaplayın. Culturing iki gün sonra, ölü hücreleri toplamak için 15 mililitrelik tüp içine her çanak orta toplamak. Daha önce açıklandığı gibi yapışık hücreleri trypsinize ve toplanan orta içeren 15 mililitrelik tüp içine hücre süspansiyon toplamak.
Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 840 kez G'de santrifüj, sonra supernatant aspire ve hücre sayma için orta bir veya orta iki ya bir mililitre ekleyin. SP-CPC'leri trypan mavisi ile lekelendirin ve canlı ve ölü hücreleri sayın. İlk olarak, hazırlanan hücrelerden orta aspire ve sıcak HBSS beş mililitre ile yavaşça durulayın.
Hücre kuluçka makinesinde beş dakika boyunca beş mililitre tripsin EDTA ile hücreleri tedavi edin. Sonra, trippsin aktivitesini durdurmak için orta bir beş mililitre ekleyin. Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında beş dakika boyunca 470 kez G'de 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüj aktarın.
Supernatant aspirate ve hücre sayımı için orta iki ekleyin. Sonra, tohum 80, 000 hücreleri orta iki üç mililitre ile önceden kaplanmış altı iyi kültür plakası her kuyuiçine. Plakayı 20 ila 24 saat boyunca 37 derecede tutun ve her kuyudaki orta yı üç mililitreye değiştirin.
Kültür 21 gün boyunca plaka, her üç günde bir orta değişiyor. Bundan sonra, bir endotel belirteci ile hücreleri leke ve diferansiye hücrelerin endotel doğasını doğrulamak için floresan mikroskopi gerçekleştirmek. İlk olarak, hazırlanan hücrelerden orta aspire ve sıcak HBSS beş mililitre ile yavaşça durulayın.
Hücre inkübatörbeş dakika için tripsin EDTA iki mililitre ile hücreleri tedavi, sonra trippsin aktivitesini durdurmak için orta üç üç mililitre ekleyin. Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında beş dakika boyunca 470 kez G'de 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüj aktarın. Supernatant aspirate ve orta üç bir mililitre ekleyin, karıştırmak için yavaşça pipetting.
Hücreleri ve tohumları 2, 000 ile 4 arasında say, orta üç mikrolitredeki 100 mikrolitredeki hücreleri 96 kuyulu bir plakanın iyi kaplanmış her matrisine kadar sayın. Plakayı 16 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, hücrelerin resmini çekmek için iki kat büyütme parlak alan mikroskobu kullanın.
Bu çalışmada kardiyak progenitor hücrelerin endotel soy bağlılığının kolaylaştırılması için uygun koşullar araştırılmıştır. Hücre birleşimi %60 veya altında olduğunda %3.5 FBS ile tedavi edilen örneklerde anlamlı bir fark görülmez. Bu birleşmedeki hücreler %0.1 FBS ile tedavi edildiğinde, fibronektin ile karşılaştırıldığında laminada hücre çoğalmalarında azalma gösterirler, ancak hücre ölümünde artış göstermezler.
Buna karşılık, yüksek bir kesişme hücrelerinin iki durum arasında hücre çoğalması veya hücre ölümü arasında anlamlı bir fark göstermez. Hücre şeklindeki değişiklikler, endotel farklılaşmasının başarılı olacağı uygun kültür koşullarının bir göstergesi gibi görüner. Endotel diferansiyasyon ortamında 7-14 gün içinde, başarılı kültürlerin farklı morfolojisi olan daha büyük hücreler içerdiği görülmektedir.
İlginçtir, bu hücreler farklılaşma aşamasının sonuna doğru kayboldu ve yüksek yoğunluklu kültürlerde daha düşük sayılarda ve daha sonraki zaman noktalarında görünme eğilimindeydi. Tüp oluşumu düşük yoğunlukta kaplanmış hücrelerde sürekli olarak başarılı olur ve laminin üzerinde ayırt edilir, yüksek yoğunluklu kaplanmış hücrelerde çoğunlukla başarısız olduğu görülür. Hücre yoğunluğuna bakılmaksızın fibronektin üzerinde kültürlenmiş hücrelerde tüp oluşumu çoğunlukla başarısız olmakla birlikte, düşük yoğunlukta farklılaşanlar bazen ilkel tüpler oluştururlar.
Endotel soyu neden serum konsantrasyonu ve hücre yoğunluğu çok önemlidir, ve canlılık korurken proliferasyon yavaşlamasını garanti etmek için ayarlanması gerekir. Soy indüksiyonu üzerine, in vivo farklılaşma potansiyellerini değerlendirmek için hücre nakli çalışmalarında insanlardan veya klinik öncesi hastalık modellerinden alınan KSK'lar kullanılabilir. Bu protokol yeni kardiyak rejenerasyon araçlarının incelenmesine veya kurulmasına yardımcı olabilir ve daha önce erken soy bağlılığının moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılmıştır.
