The authors have no conflicts of interest to disclose.

Yetişkin Tüm Blood 1. Zenginleştirme Hematopoetik Progenitor Hücreleri Not: hematopötik projenitör hücreleri ve CD34 + hücreleri yoğunluk gradyan santrifüj göre yöntemler kullanılarak kordon kanı, lökoferez malzeme ve tam kan da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilmiş periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), saflaştırılabilir. Burada listelenen yöntem örnek olarak tam kan kullanır. <ol><li> Tüm kandan PBMC izole edilmesi: <ol><li> Ekin merkezi delikten pipetleme SepMate tüpüne lenfosit ayırma ortamı 4,5 ml ilave edilir. </li><li> % 2 insan serumu içeren steril DPBS eşit hacimde kan örneği seyreltin (hac / hac). Örneğin, DPBS +% 2 insan serumu, 5 ml numune 5 mi seyreltin. </li><li> Tüpün yan aşağı pipetleme seyreltilmiş örnek ekleyin. Merkezi delikten doğrudan örnek dökmek için değil dikkat edin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1200 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle PMBC katmanın üzerinde süpernatant kaldırmak. </li><li> Yeni bir tüp içine PBMC katmanı (bulutlu) toplayın. </li><li> Frenden ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 150 x g&#39;de,% 2 insan tüpüne serum ve santrifüj içeren Dulbecco fosfat-tamponlu salin (DPBS) 15 ml ilave edilir. </li><li> Süpernatant atılır ve% 2 insan serumu ihtiva eden DPBS 15 ml pelletini. Hücrelerin sayısını. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 690 x g&#39;de santrifüjleyin. Tüpten tüm süpernatantı. </li><li> 15 1% antibiyotik içeren Iscove değiştirilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) ml (h / h) ve% 10 insan serumu, 1 x 10 7 hücre yeniden süspanse hücreleri (hac / hac). </li><li> CD34 + hücreleri izole önce% 5, 37 ° C&#39;de CO2 kuluçka hücreleri O / N inkübe edin. </li></ol></li><li> CD34 Multisort Kit kullanılarak PBMC&#39;lerden CD34 + hücrelerinin pozitif seçim: NOT: Hızlı çalışın ve soğuk hücreleri yapmak için önceden soğutulmuş çözümleri kullanmak ve kuafajı önlemekkit talimat başına hücre yüzeyinde ve non-spesifik hücre etiketleme antikorların. <ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde, tüm PMBCs toplayın ve ortamdaki toplam hücre sayısı. </li><li> 10 dakika için 300 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Tamamen tüm süpernatantı. </li><li> 10 8 boncuk tampon maddesi içinde 300 ul başına hücre (DPBS ihtiva eden% 0.5 insan serumu (h / h) ve 2 mM EDTA) &#39;ye kadar yeniden süspanse edin. </li><li> FcR Engelleme Reaktif 100 ul ekleyin ve CD34 MultiSortMicroBeads 100 ul ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve buzdolabında 30 dakika süreyle kuluçkalayın (2-8 ° C). </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de kordon 10 8 hücre başına tampon ve santrifüj 2 ml ekleyerek hücreleri yıkayın. Tamamen süpernatantı. </li><li> Tampon 500 ul 10 8 hücrelere kadar yeniden süspanse edin. </li><li> Bir MACS Ayırıcı manyetik alan MACS LS kolonu yerleştirin ve boncuk tamponu, 3 ml ile durulama kolon hazırlanmıştır. </li><li> Cente üzerine hücre süspansiyonu Uygulasütun r. Etiketsiz hücreleri tercih eğer içinden toplanabilir akacaktır. </li><li> Yıkama kolon boncuk tamponu, 3 ml ile üç kez. </li><li> Ayırıcıdan gelen sütun çıkarın ve 15 ml&#39;lik bir tüp üzerine yerleştirin. </li><li> Kolona boncuk tampon 5 ml ekleyin ve hemen sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri dışarı floş. </li><li> Hücre süspansiyonunun 1 ml&#39;si başına Multisort salıcı ayıraç 20 ul ekle. İyice karıştırın ve buzdolabında 10 dakika süreyle kuluçkalayın (2-8 ° C). </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri 10 7 hücre başına boncuk tamponu 2 ml ve santrifüj - 1 ekleyin. Tamamen süpernatantı. </li><li> 10 7 hücre başına boncuk tampon 50 ul süspanse hücreleri. </li><li> 10 7 hücre başına Multisort Durdurma Reaktifi 30 ul eklenir ve buzdolabında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri boncuk tampon 5 ml ilave edilir ve santrifüj. Süpernatantı atın. </li></ol></li></ol> CD34 + Hücreleri Bağlı Sinir Kök Hücre 2. türetilmesi <ol><li> CD34 + hücreleri, kültür: Not: buzdolabında saklandığında Taze hazırlanmış ortam 7 gün içinde kullanılmalıdır. Önemli CD34 hücreleri kaybı 24 saat sonra gözlenen olabilir ama hücre sayısı sürekli azalır veya çoğalma varsa hücrelerinin çoğalması önemli özellikle gün 5. sonra, fark olmalı, kötü, orta veya CD34 hücrelerinin kalitesini ve hücreleri ya ima bir sonraki aşama için kullanılmamalıdır. <ol><li> CD34 süspanse Kültür CD34 + hücreleri (insan trombopoietin ihtiva eden (StemSpan SFEM ortamı SCF (TPO, 100 ng / ml), fms-benzeri tirosin kinaz 3 (Flt-3) ligandı (100 ng / ml) ve kök hücre faktörü orta muhafaza 100 ng / ml), interlökin-6 (IL-6, 20 ng / ml) ve interlökin-7 (IL-7, 24-çukurlu plaka içinde 20 ng / ml)) (en fazla 3 x 10 5 / kuyuda % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de oyuk başına ortam) 1 ml&#39;lik. </li><li> After 24 saat, yüzen hücreleri toplamak ve herhangi bir bağlı hücre ve hücre enkaz kurtulmak için oda sıcaklığında 110 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Süpernatant atılır ve ilave 5 gün için% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de, yeni bir 24 oyuklu plaka (de kadar, 1 x 10 5 /) taze CD34 muhafaza ortamı ve tohum, 1 ml süspansiyon hücrelerin. </li><li> CD34 + hücreleri kuyularda (Şekil 1A) alt kısmında yüzen sırasında dikkatli bir şekilde yüzer üst yarısını aspire ortamı her gün yarısı değiştirin. </li></ol></li><li> Sendai virüsü transfeksiyonu: <ol><li> 5. günde, CD34 hücreleri toplamak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 170 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Süpernatantı atın. </li><li> De 1 ml ortam maddesi, 24 oyuklu bir plakada 1 x 10 5 / taze ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Ilk 10 saniye boyunca bir 37 ° C su banyosu içinde tüpler taban daldırılmasıyla bir cytotune-iPS Sendai yeniden programlama kiti çözülme ve daha sonra tamamen çözülmet RT. Kısaca tüpleri santrifüj ve buz üzerine koydu. Ilgili lot için Analiz Sertifikası (COA) listelenen her virüsün tavsiye hacmini karıştırılmasıyla Sendai virüsü karışımı hazırlayın. İçişleri Bakanlığı 15 tavsiye edilir. </li><li> CD34 hücrelerinin her oyuğuna Sendai virüsü karışımı ekleyin. Hafifçe sallayarak kuyu karıştırın. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> 24 saat sonra transfeksiyon verimliliği gözlemleyin. Hücre gruplar ve küre oluşumu başarılı transfeksiyon (Şekil 1B) için göstergeler olduğuna dikkat edin. </li><li> Dikkatli bir orta üst yarısını aktararak kuyunun orta yarısı değiştirin. Yeni bir kuyudaki hücre küre ise, taze ortam ile aynı miktarını ekleyin. </li><li> Adım 2.2.6 yineleyerek gün orta her değiştirin. </li></ol></li><li> Sinir kök hücre indüksiyon: Not: Hücre koşullarına bağlı olarak, yaklaşık 5 ila 7 gün sonra transfeksiyon, tek tabaka yapışan hücreler 30 ulaşacak -% 50 kaynaşma (Şekil 1C). <ol><li> Besin Karışımı, F-12 1x N2 ek,% 0.1 (a / h) sığır serum albümini içeren (DMEM / F12), ((Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı yüzen hücreler ve küreler içeren süpernatanlarm çıkarın ve nöral projenitör ortamın 1 ml ilave BSA),% 1 (h / h) antibiyotikler, bazik fibroblast büyüme faktörü ve 20 ng / ml (bFGF), ve yapışkan hücreler içine, epidermal büyüme faktörü (EGF)), 20 ng / ml olmuştur. </li><li> İsteğe bağlı olarak, hafifçe pipetleme hücre küreler ayırmak ve 10 dakika boyunca 170 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Süpernatantı ve geri kadar komut başına Matrigel ile kaplanmış bir yeni 24 oyuklu bir plaka içerisinde, sinirsel kök ortamı, 1 ml süspansiyon hücrelerin. </li><li> % 80 konfluent genellikle 1 hafta sonra, - hücreler 60 ulaşana kadar her gün orta değiştirin. </li><li> Süpernatantı atın ve nöral kök hücre ortamı (serum serbest ortamda, MGK SFM) 1 ml ekleyin. Ardından hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırmakÇok nazik pipetleme. </li><li> Hücreleri çıkarın ve 6 oyuklu plakanın bir kuyuya hepsi tohum. Nöral kök hücre ortamının bir 1 mi, her oyuğa 2 mi ortam yapmak ekleyin. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> Geçen gün orta her değiştirin. </li><li> Hücreler% 60 izdiham ulaştığında, ayırmak ve 1 hücreleri Replate: 2.3.4 ve 2.3.6 adımları izleyerek 3 oranında. </li></ol></li><li> Nöral kök hücrelerin dondurulması: <ol><li> Nöral kök hücre ortamına% 20 dimetil sülfoksit (DMSO) ilave edilerek orta dondurma nöral kök hücre hazırlayın. Buz üzerinde dondurma orta tutun. </li><li> Hafifçe pipetleme ve ardından hücre kazıyıcı kullanarak, 6-çukurlu plaka içindeki hücreleri ayırmak. Hücreleri saymak. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 170 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> 1 x 10 6 / ml nöral kök hücre ortamı hücrelerin tekrar. Hücrelere orta dondurma aynı hacimde ekleyin. </li><li> 1 ml (5 x 1 eklemeBir dondurarak saklama viali hücre 0 5 toplam hücre). Talimat aşağıdaki Bay Froster dondurma kabı kullanarak hücrelerin dondurun. </li></ol></li></ol> 3. Sinir Hücre Farklılaşması <ol><li> Nöronal hücre farklılaşması: <ol><li> Nöral kök hücreler% 80 izdiham ulaştığınızda, bir lastik polis ile nöral kök hücreleri ayırmak ve daha sonra yavaşça pipetleme ayırmak. </li><li> Hücre sayımı ve nöral kök hücre ortamı içinde 1 x 10 5 ug / ml konsantrasyonu ayarlanır. </li><li> Nöronal farklılaşma için, poli-D-lisin / laminin kaplanmış kapak hücreleri plaka, 1 x 10 5/24-yuvalı plakalar içinde kayar. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> Sinir farklılaştırma ortamının orta yerine (DMEM 1x N2 ek, 1 x B27 ek, 300 ng / ml cAMP, 0.2 mM C vitamini, nörotrofik faktör (BDNF edilen 10 ng / ml beyin) ve 10 ng / ml, glial hücre içeren / F12 türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF)) after 24 saat. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> 2 hafta boyunca haftada iki kez nöral farklılaşma ortamı değiştirin. </li></ol></li><li> Astroglial farklılaşma: <ol><li> Pipetle nöral kök hücreleri ayırmak. </li><li> Hücre sayımı ve 5 x 10 4 hücre / ml hücre konsantrasyonunu ayarlamak. 24 oyuklu plakalar üzerine hücreleri Tohum. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile DMEM / F12 ortamı yerine ve% 5 CO2 inkübatörü içinde 37 ° C&#39;de kuluçkalayın. </li><li> 2 hafta boyunca haftada iki kez orta değiştirin. Hücreler 2 hafta önce izdiham ulaşmak, adımlar 3.2.1 ve 3.2.2 Aşağıdaki hücrelerin Replate. </li></ol></li><li> Oligodendrosit farklılaşması: <ol><li> Pipetle nöral kök hücreleri ayırmak. </li><li> Oligodendrosit farklılaştırılmaktadır 1 ml hücreleri ve tohum poli-L-ornitin kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine 1 x 10 5 hücre sayımN2 ek içeren DMEM / F12, trombosit türevli büyüme faktörü-AA (PDGF-AA) 10 ng / ml, nörotrofin-3 (NT-3), 2 ng / ml, sonik kirpi 2 ng / ml içeren tirme ortamı ( Sus), ve triiodotironin (T3 3 nM). CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> 2 hafta boyunca haftada iki kez orta değiştirin. </li><li> DMEM / 1xN2 takviyesi ile F12 ve T3 3 nM ve kültür miyelin bazik proteini (MBP) üretimi için bir hafta daha hücreler ortam değiştirin. </li></ol></li></ol> 4. İmmünofloresan Boyama <ol><li> % 4 paraformaldehid (PFA) ile değiştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> PFA atın ve PBS% 0.1 Triton X-100 (PBS-T) ile 3 kez, her biri 5 dakika süre ihtiva ile yıkayın. </li><li> PBS oda sıcaklığında 10 dakika süre ile,% 0.5 Triton X-100 içeren hücreler geçirgenliği. </li><li> PBS-T, oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 keçi serumu içeren hücreler bloke eder. </li><li> Karşılık gelen birinci Antibo kuluçkaya bırakılırsoğuk bir odada, oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat boyunca% 0.1 BSA içeren PBS-T ile sulandırılmış kalıplar. </li><li> PBS-T, her biri 5 dakika süre ile 3 kez hücreleri yıkayın. Karanlıkta bir karıştırıcı üzerinde 1 saat boyunca% 0.1 BSA içeren PBS-T 400 seyreltme: 1 kullanarak bir fluorokrom ile birleştirilmiş ikincil antikor tekabül eden hücreleri inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren PBS-T hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika her biri PBS-T ile hücreler iki kez daha yıkanır. </li><li> Bir mikroskop kullanılarak etiketli hücreleri gözlemleyin ve almak fotoğraflar (Şekil 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny.">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS ONE. 6, e20941 (2011).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroblast+assay:+an+assay+for+the+generation+and+enrichment+of+neuronal+progenitor+cells+from+differentiating+neural+stem+cell+progeny+using+flow+cytometry.">The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Human+Huntington's+Disease+Cell+Model+from+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells.</a> PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+patient+specific+iPS+cells+as+a+novel+approach+to+study+the+pathophysiology+of+multiple+sclerosis.">Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis.</a> Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons.">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).</li><li>Lee, S. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Generation+of+Neurosphere-Like+Cells+from+Human+Dermal+Fibroblasts.">Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts.</a> PLoS ONE. 6, e21801 (2011).</li><li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+into+Stably+Expandable+Neural+Stem+Cells.">Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., S&#252;dhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+stem+cells+from+human+adult+peripheral+CD34++cells+for+an+autologous+model+of+neuroinflammation.">Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 8, e81720 (2013).</li><li>Jin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Sendai+virus+provides+a+highly+efficient+gene+transfer+into+human+cord+blood-derived+hematopoietic+stem+cells.">Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells.</a> Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).</li><li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+(iPSCs)+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors.">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).</li><li>Goolsby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitors+express+neural+genes.">Hematopoietic progenitors express neural genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).</li></ol>

The study is funded by NIH intramural funds.

Doğrudan periferik hematopoetik progenitör hücrelerden sinir kök hücreleri üretmek için detaylı bir protokol sağlanır. Fibroblast hücreleri ile karşılaştırıldığında, insan periferal kan daha erişilebilir. Sunulan protokol fazla 1 x 10 5 hematopoietik progenitör hücreler veya CD34 pozitif hücreleri kullanarak, tam kan, 10 ml zenginleştirilebilir. LuM trombosit toplayıcı U kirlenme genellikle önlenebilir olmasa da, kolayca düşük hızlı santrifüj ile a...

In vitro nöronal kültürler nörolojik hastalıkların çalışmaları için temel bir araç olarak kullanılmıştır. Birincil hayvan (çoğunlukla, kemirgen) bir sinir kültürlerinin 1, 2 ve gliom ve diğer tümörlerinden türetilmiş insan nöral hücre çizgileri, en yaygın olarak kullanılan bu tür çalışmalar bulunmaktadır. Bununla birlikte, kemirgen ve insan hücreleri arasında önemli farklılıklar olduğu kabul edilmiştir. Kemirgenler dayalı birçok bulgular insanlara tercüme edilemez. Ayrıca, kitle genomik bilgiler ve nispeten kolay gen düzenleme ve tüm genom sıralamasını analiz hızlı gelişmeler, eğilim daha dişli birkaç insan nöronal kılan, hastalık eğilimli genler keşfetmek ve belirli hastalıklarda işlevlerini ve rollerini ortaya koymayı amaçlayan bir hücre hatları, sadece kullanım sınırlıdır. Teorik olarak, hasta sinir sisteminin örneklerinden elde edilen insan primer sinir kültürleri en iyi seçimdir ama elde etmek imkansız; dolayısıyla alternatif metODS gereklidir. Son yıllarda, bazı yaklaşımlar iki en ayırt olmak, takip edilmiştir. Üretilmesi uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) kullanılarak fare ve insan somatik hücre tekniğin geliştirilmesi eden 3, 4, nöral hücreler, bunlardan 5-7 den daha farklı olabilir. Ancak, üreten ve IPSC karakterize yoğun emek, teknikleri, ve zaman giriş talepleri, hatta bazen engelleyici. Kısa bir süre sonra, bir başka yaklaşım doğrudan somatik hücre 8, 9 ile ilgili nöronal hücrelerini transforme etmek üzere geliştirilmiştir. Elde edilen nöronlar proliferatif olmayan olduğu için, yoğun çalışmalar ve hücre büyük miktarda gerektirir ilaç tarama, içinde bunun uygulanmasını kısıtlar. Her iki teknikler, nöral kök doğrudan türetme avantajları almak için / somatik hücrelerden progenitör hücreleri hala iPSC üretimi ve karakterizasyonu ama yazarlara sıkıcı sürecini atlar çeşitli gruplar 10-12 tarafından araştırılmaktadırdes sonra nöral farklılaşma için nöral kök hücrelerin iyi bir sayı. Biz daha önce hematopoetik progenitör hücrelerin içine Yamanaka transkripsiyon faktörlerinin giriş izleyen, nöral kök hücreler doğrudan ortamı 13 seçerek bir nöral progenitör hücre kullanılarak oluşturulan olabileceğini göstermiştir. Burada, biz detaylı yöntem rapor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Material List</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Name</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:72px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:171px;">Lonza</td>
			<td style="width:135px;">17-829E</td>
			<td style="width:72px;">1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">SepMate</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:135px;">15415</td>
			<td style="width:72px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Human Serum</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">34005-100</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">15240-062</td>
			<td align="right" style="width:72px;">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">CD34 MultiSort Kit</td>
			<td style="width:171px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-056-701</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Cellgro</td>
			<td style="width:135px;">46-034-Cl&#160;</td>
			<td style="width:72px;">2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">MACS LS Column</td>
			<td style="width:171px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-042-401</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">StemSpan SFEM Medium</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:135px;">9650</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IMDM</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">112-035-101</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">TPO</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-18</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Flt-3</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-19</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">SCF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-07</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IL-6</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">200-06</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IL-7&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">200-07</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IPS Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A1378001</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:171px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:135px;">83.183</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DMSO</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">D2650</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">CryoTube vials</td>
			<td style="width:171px;">Thermo</td>
			<td align="right" style="width:135px;">368632</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Mr. Frosty container</td>
			<td style="width:171px;">Thermo</td>
			<td style="width:135px;">5100-0001</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">12400-024</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A2934</td>
			<td style="width:72px;">0.1% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">bFGF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">100-18B</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">EGF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-15</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">17504-044</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">NSC serum free medium</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">A1050901</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:208px;">Poly-D-lysine/laminin coated cover slips</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">BD Bioscences</td>
			<td align="right" rowspan="2" style="width:135px;">354087</td>
			<td rowspan="2" style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">cAMP</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A9501</td>
			<td style="width:72px;">300 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A0278</td>
			<td style="width:72px;">0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">BDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-02</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">GDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-10</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P4957</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PDGF-AA</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">100-13A</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">NT-3</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-03</td>
			<td style="width:72px;">2 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Shh</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">1314-SH/CF</td>
			<td style="width:72px;">2 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">T3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T6397</td>
			<td style="width:72px;">3 nM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PFA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6148</td>
			<td align="right" style="width:72px;">4%</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:208px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological</td>
			<td style="width:135px;">119-069-101</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Goat serum</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G9023</td>
			<td align="right" style="width:72px;">4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T9284</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Mouse monoclonal anti-Nestin</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">AB5922</td>
			<td style="width:72px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Anti-SOX2&#160; antibody</td>
			<td style="width:171px;">Applied Stemcell</td>
			<td style="width:135px;">ASA0120</td>
			<td style="width:72px;">Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Mouse anti-&#946;III-tubulin antibody</td>
			<td style="width:171px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">G712A</td>
			<td style="width:72px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:208px;">Rabbit anti-GFAP antibody</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G4546</td>
			<td style="width:72px;">1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Anti-O4 antibody</td>
			<td style="width:171px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">MAB1326</td>
			<td style="width:72px;">IgM; 1 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:208px;">Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A11012</td>
			<td style="width:72px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:208px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A11001</td>
			<td style="width:72px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A21042</td>
			<td style="width:72px;">1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">D9542</td>
			<td style="width:72px;">1 ug/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct induction of human neural stem cells from peripheral blood hematopoietic progenitor cells

İnsan hastalıkları spesifik nöronal kültürler insan nörolojik hastalıklar için in vitro bir model oluşturmak için gereklidir. Ancak, birincil insan yetişkin nöral kültürlere erişim eksikliği benzersiz zorluklar yükseltir. Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin son gelişmeler (iPSC) hastaya özel IPSC yoluyla deri fibroblastlar nöral kültürleri türetmek için alternatif bir yaklaşım sağlar, ancak bu süreç emek yoğundur, özel uzmanlık ve kaynakların büyük miktarda gerektirir, ve birkaç ay sürebilir. Bu nörolojik hastalıkların çalışma Bu teknolojinin geniş bir uygulama önler. Bu sorunlardan bazılarının üstesinden gelmek için, biz iPSC derivasyon işlemini atlayarak, doğrudan insan yetişkin periferal kanından sinir kök hücreleri elde etmek için bir yöntem geliştirdik. Insan yetişkin periferal kanından zenginleştirilmiş hematopötik projenitör hücrelerin in vitro olarak kültürlendi ve Ekim transkripsiyonel faktörler Sox2 içeren Sendai virüsü vektörleri ile transfekte3/4, Klf4 ve c-Myc. ayrıca, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) içeren insan nöral projenitör ortamı kullanılarak seçilmektedir hücrelerinde morfolojik değişiklikler transfeksiyon ile sonuçlanır. Elde edilen hücreler, Nestin ve Sox2 gibi nöral kök hücre işaretçileri için ekspresyonu ile karakterize edilir. Bu nöral kök hücreler ayrıca nöronların, astroglial ve belirtilen farklılaşma medya oligodendrositlere ayırt edilebilir. Kolayca erişilebilir insan periferal kan örnekleri kullanarak, bu yöntem, nörolojik bozukluklar, in vitro model için nöral hücrelere daha fazla farklılaşması için nöral kök hücrelerini elde etmek için kullanılabilir ve bu hastalıkların patojenezinde ve tedavi ile ilgili çalışmalar ilerleyebilir.

<html> CD34 hücrelerinin kalitesi nöral kök hücre naklinin başarısı için kritik öneme sahiptir. Yüksek kaliteli CD34 hücreleri kültür ilk birkaç gün boyunca çoğalırlar ve sadece kültür damarları (Şekil 1A) alt üzerinde yüzen, sigara yapışık, homojen yuvarlak hücreler olarak görünür. Hücre genişletmek spesifik olmayan hücre agrega hücre kültürü sırasında oluşabilecek ise, zaman (Şekil 1B) üzerinden genişletir agrega, ve dernek başarılı enfeks...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells at JoVE.com

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

direct-induction-human-neural-stem-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K Görüntüleme.  National Institutes of Health.  Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir. 

Video: Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro is essential for mechanistic studies of the endothelial-hematopoietic transition and hematopoietic specification. Here, we describe a method for the efficient induction of HE from human pluripotent stem cells (hPSCs) by way of overexpression of different sets of transcription factors. The combination of ETV2 and GATA1 or GATA2 TFs is used to induce HE with pan-myeloid potential, while a combination of GATA2 and TAL1 transcription factors allows for the production of HE with erythroid and megakaryocytic potential. The addition of LMO2 to GATA2 and TAL1 combination substantially accelerates differentiation and increases erythroid and megakaryocytic cells production. This method provides an efficient and rapid means of HE induction from hPSCs and allows for the observation of the endothelial-hematopoietic transition in a culture dish. The protocol includes hPSCs transduction procedures and post-transduction analysis of HE and blood progenitors.

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...