Yöntemimiz fare embriyonik kök hücrelerinden kalp alanına özgü kardiyak progenitor hücreleri üretmeyi amaçlamaktadır. Bu kalp alanı muhabiri kök hücre hattı, genetik ve farmakolojik manipülasyona uygun bir sistem sağlayarak, konjenital kalp hastalığının altında yatan mekanizmaların yüksek iş bölümü çalışmasına olanak sağlar. Odaya özgü çeşitli konjenital kalp hastalıkları vardır.
Bu protokol, kardiyogenezin in vitro recapite ile hastalık mekanizmasının incelenmesine ve gelecekteki rejeneratif tedavilerin geliştirilmesine olanak sağlamaktadır. Bu protokol, kalp gelişimi sırasında farklı odaların kardiyak ata hücrelerinin nasıl belirtildiğihakkında bilgi sağlayabilir. Transgenik fare embriyonik kök hücrelerini %0,1 jelatin kaplı T25 şişelerinde 2i ortamda büyüterek başlayın.
Hücreler %70 ila %80 birleştiğinde, PBS ile kültürleri durulayın ve kültürü 37 derecede 37 derecede tek hücrelere ayırmak için şişe başına bir mililitre tripsin ekleyin. Hücreler ayrıldığında, DMEM dört mililitre 10 FBS ile reaksiyon nötralize ve uygun bir yöntemle hücreleri saymak. Hücreleri yaklaşık üç kez 10 taze orta konsantrasyon başına beş hücreye seyreltin ve santrifüj ile hücreleri toplamak.
Daha sonra yeni 0.1% jelatin kaplı T25 şişeleri üzerine rekaplama için taze 2i orta beş mililitre pelet resuspend. Kardiyak spheroidlerden TBM üretimi için, 2.5 kat 10 ile altı ayırımlı transgenik fare embriyonik kök hücre örneğini santrifüj ile toplayın ve 25 mililitre SFD ortasında hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 37 santigrat derecede kuluçka için 150 ila 25 milimetrelik steril bir plakaya ve 48 saat boyunca %5 karbondioksite yerleştirin.
Kuluçka sonunda, konik bir tüp içine kardiyak spheroids toplamak. Spheroidlerin selektif izolasyonunu kolaylaştırmak ve tek hücrelerden kaçınmak için spheroidleri santrifüj ile tortula çökün. Taze SFD orta 25 mililitre küresel leri yeniden askıya aktivin A mililitre başına bir nanogram ve kemik morfogenetik protein dört mililitre başına 1.5 nanogram ile takviye.
Hücre kültürü kuluçka makinesinde 24 saatlik kuluçka için sıçrıcıları aynı kültür plakasına geri yerleştirin. Ertesi gün, tüm kardiyak küresel leri santrifüjle hatırlayın. Ultra düşük bir eki, hücre kültürü kuvözde 75 santimetre karelik şişede 48 saat kaplama için 25 mililitre taze SFD ortamda farklılaşmış embriyoid cisimleri yeniden askıya alın.
Floresan muhabirler kullanarak kalp alanına özgü TBM izolasyon için, santrifüj ile embriyoid organları toplamak ve üç dakika boyunca 37 santigrat derece trypsin bir mililitre ile 3D kültürleri ayrıştırın. Kuluçka sonunda, hücreleri ayrıştırmak ve DMEM'de dört mililitre 10 FBS ile reaksiyonu nötralize etmek için pipetleme ile iyice karıştırın. Ayrık olmayan embriyoid cisimleri çıkarmak için karışımı 70 mikrometrelik bir süzgeç üzerine geçirin ve filtrelenmiş hücreleri santrifüj ile tortulayın.
CpC'leri floresan muhabir ifadelerine göre sıralamak için, 500 mikrolitre FACS çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın ve hücreleri 40 mikrometrelik hücre süzgecinden geçirerek buz üzerinde beş mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpüne filtreleyin. Daha sonra hücreleri, RFP ve GFP ifade eden hücreleri FACS ile izole etmek için sıralayın ve hücreleri bir mililitre FBS'de toplayın. Yüzey proteini Cxcr4 ekspresyonuna göre birinci ve ikinci kalp alanı CpC'lerini izole etmek için, pbs'de %10 FBS'nin 300 mikrolitresinde tek fare embriyonik kök hücre RFP ifade eden tek fare embriyonik kök hücre RFP ifade eden floresan-konjuge anti-Cxcr4 antikor ile desteklenmiştir.
Oda sıcaklığında beş dakika sonra, yıkama başına taze, soğuk PBS bir ila iki mililitre hücreleri üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 500 mikrolitre FACS çözeltisindeki hücreleri yeniden askıya alın ve hücreleri 40 mikrometrelik bir süzgeçten beş mililitrelik yuvarlak alt tüpe süzün. Daha sonra hücreleri Cxcr4 ekspresyonuna göre sıralayın ve hem Cxcr4-pozitif hem de negatif popülasyonları buz üzerinde tüp başına bir mililitre FPS içeren tek tek tüplerhalinde toplayın.
FACS izole, kalp alanına özgü kardiyak progenitor hücreleri yeniden kültürlendirmek için, santrifüj tarafından sıralanmış hücreleri toplamak ve SFD ortamda pelet resuspend. Sonra yaklaşık üç kez 10 iyi başına dört hücre için tohum 0.1% jelatin kaplı, 384-iyi plaka. Artan hücre ölümü sıralama sonra belirtilirse, her kuyuya 10 mikromolar ROCK inhibitörü ekleyin.
Kültür iki gün sonra, spontan dayak gözlenmelidir. Kaplama lı CpC'lerin kardiyomiyositlere ayırt olma yeteneğini analiz etmek için, tek kardiyomiyositleri izole etmek ve %4 paraformaldehitte hücreleri yeniden askıya almak için, tripsin ile 12. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, santrifüj ile sabit hücreleri toplamak ve aşırı fiksatif kaldırmak için PBS pelet yıkayın.
Daha sonra, PBS%10 FBS hücreleri resuspend ve fare anti-troponin T antikor ile hücre örneğinin yarısını kuluçka ve negatif kontrol olarak örneğin diğer yarısını kullanın. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, hücreleri taze PBS'de iki kez yıkayın ve uygun bir ikincil antikor la birlikte %10 FBS artı PBS'de numuneleri yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında başka bir 30 dakikalık kuluçka sonra, yıkama başına taze PBS hücreleri iki kez yıkayın ve bir akış sitometre üzerinde analiz için tüp başına PBS 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.
Yaklaşık 132 saatlik farklılaşmadan sonra, Tbx1-RFP ve Hcn4-GFP kardiyak progenitor hücreleri floresan mikroskopi ile saptanabilir. Genellikle, hem GFP hem de RFP hücreleri yaklaşık olarak aynı zamanda görünür ve progenitor hücrelerinin iki popülasyonu yakın ve tipik olarak tamamlayıcı bir desende genişlemeye devam eder. Aktivin A ve kemik morfogenetik protein 4 konsantrasyonlarının ayarlanması birinci ve ikinci kalp alanı kardiyak progenitor hücrelerinin yüzdelerini değiştirecek.
Benzer şekilde, bir RFP muhabiri fare embriyonik kök hücre hattı kullanarak, farklılaşma 132 saat sonra, RFP-pozitif kardiyak progenitor hücreleri görünür. Cxcr4, RFP-pozitif, Cxcr4-pozitif ve RFP-pozitif için immünboyama sonra, Cxcr4-negatif hücreler izole edilebilir. Diferansiyasyonun 12.
Benzer şekilde, RFP-pozitif, Cxcr4-negatif kardiyak progenitor hücrelerinden elde edilen hücreler, Cxcr4 tek pozitif kardiyak progenitor hücrelerine göre çok daha yüksek yüzdelerde kardiyomiyositlere yol açar. Bazen, fare embriyonik kök hücreleri verimli bir şekilde ayırt etmek ve kalp alanına özgü kardiyak ata hücrelerinin çok düşük sayıda oluşturmak için başarısız. Zamanlaması, konsantrasyonu, sitokinlerin eklenmesi ve hücrelerin sayısı oda kendine özgü kardiyak progenitor hücrelerin başarılı bir nesil için önemlidir.
Bu prosedürü takiben, araştırmacılar kardiyak progenitor hücrelerinin farklı popülasyonlarının fizyolojik özelliklerini analiz ederek özellikleri ve işlevleri hakkında daha fazla bilgi edinebilirler.
