Afrika tripazomlar insan Afrika tripomiazis sorumludur, ya da uyku hastalığı ve hayvan Afrika tripsomiazis. Uyku hastalığına neden olan trypanosomes tsetse sinek sahra altı Afrika'da birçok coğrafi odak mevcut protist parazitler iletilir. Parazitin saptanması tanı, tedavi ve takip için gereklidir.
Bir seroloji yanlış pozitif ve ne yazık ki, yanlış negatif sonuçlar verebilir. Kanda tespit yardımcı olmak için, trypanosomes konsantre olması gerekir. Çeşitli parazit konsantrasyonteknikleri kullanılmıştır.
En hassas yöntem, parazitlerin kandan anion değiştirici, DEAE selüloz ve ardından santrifüj ve mikroskobik gözlem sütunu ile ayrılmasıdır. Sonuç olarak, DEAE selüloz yöntemi en iyi ve bugüne kadar kalır, insan Afrika triposomiazis tanısı için kandan parazitlerin görselleştirilmesi ve izole için referans yöntemi, özellikle alan koşullarında. Bu yöntem, Afrika tripsomiazis için en uygun tanı da immünolojik, biyolojik, biyokimyasal, farmasötik ve moleküler biyolojik araştırmalar için saflaştırılmış parazitler sağlar.
Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı kılavuzuna uygun tüm araştırmalar ve fransız yetkililerden mutabakat sağlandı ve kullanılan tüm protokoller yerel etik kurulumuz tarafından onaylandı. Her maddeyi yazılı protokole göre tartın. Distile su ekleyin ve aşağıdaki tamponlanmış çözeltiler, konsantre fosfat tampon 2X yapmak için potasyum dihidrojen fosfat ile pH 8 tam ayarlayın.
Fosfat tamponlu tuzlu glikoz için distile su ve glikoz ekleyin. Elüsyon tampon 100 mililitre için, penisilin mililitre başına 100 birim ekleyin, streptomisin mililitre başına 100 mikrogram, ve fosfat tamponlu tuzlu glikoz fenol kırmızı sıyrık beş mikrogram mililitre. DEAE selüloz 100 gram ilk distile su üç litre ile yıkanır ve daha sonra yerleşmek için bırakılır.
İnce parçacıklar atılır. Yıkarlar süpernatant temizolana kadar tekrarlanır. Konsantre fosfat tamponlu salin 2X eklenir ve DEAE selüloz karıştırılır.
PH bir molar potasyum fosfat ile sekiz ayarlanır. Selüloz daha sonra iki kez distile su ile yıkanır ve iki kez fosfat ile tamponlu tuzlu glikoz ile. DEAE selüloz ve fosfat tamponlu tuzlu glikoz eşit hacimlerde karıştırılır.
Alaşım dörtte bir ve oda sıcaklığında veya dört santigrat derece veya eksi 20 derece santigrat uzun depolama için saklanır. Trypanosome enfekte kan sıvı nitrojen depolanır. Bir mililitrealaşım kuvars oda sıcaklığında çözülür.
Parazitler bir iğne ve bir mililitreşöyiş şırınga kullanılarak kriyotube'dan dikkatlice toplanır. Çözülmüş parazitlerin canlılığı, enfeksiyon öncesi ışık mikroskobu gözlemi ile görselleştirilen hareketlilik ile değerlendirilir. Parazitler fare başına 500 mikrolitre olan iki farenin periton boşluklarına enjekte edilir.
Her gün enfeksiyon sonrası, paraziti bir iğne ile kuyruk kan damlası toplayarak değerlendirilir ve mikroskopi ile kontrol edilir. Paraziti uygun bir düzeyde olduğunda, enfekte kan toplanır. 10 mililitrelik şırınga bir kelepçe veya tutucu da desteklenir ve önceden kesilmiş bir filtre kağıdı eklenir.
Hazırlanan DEAE selüloz sekiz veya dokuz mililitre seviyesine kadar şırınga içine dökülür. Sütun elüsyon arabelleği ile yıkanır. Enfekte kan iki mililitre dikkatle sütunun üstüne yerleştirilir ve trypanosomes sütun da 50 mililitre santrifüj tüpü eluate toplanır.
Elüsyon tamponu düzenli olarak trypanosomes transit göre eklenir. Kolon üzerinden tripatozomların geçişi düzenli aralıklarla kolon eluate bir damla alarak ve ışık mikroskopisi kullanılarak tripatozomlar için gözlemleyerek kontrol edilir. Tripanozomlar artık eluate gözlenmediğinde, konik tüp 1, 800 kez G 10 dakika dört santigrat derece santrifüj edilir.
Supernatant atılır ve palet içinde trypanosomesomes bir hemositometre ile sayılır. Toplanan trypanosomes daha sonra planlanan soruşturma için gerekli ortamda seyreltilir. Bu yöntem, Afrika tripsomiazis için en uygun tanı immünolojik, biyolojik, biyokimyasal, farmasötik ve moleküler biyolojik araştırmalar için saflaştırılmış parazitler sağlar.
DEAE selüloz saflaştırılmış parazitler kolayca doğal veya deneysel enfekte konaklar ve özellikle, kemirgenler büyük miktarlarda elde edilebilir, çünkü bu çalışmalar geliştirilmiştir. Farmasötik ajanların varlığında tripatozom canlılığı mikroskobik gözlem ile değerlendirilir. Parazit canlılığı hareketlilik ile ilişkilidir ve bu nedenle, 40 kat veya daha yüksek büyütme bir ışık mikroskop altında göz ile kontrol edilebilir.
Parazit canlılığı hareketli formların yüzdesi ölçülerek değerlendirilir. Test bileşiklerinin seyreltmeleri 96 kuyulu doku kültürü plakasının her kuyuya eklenirken, kontrol kuyuları sahte olarak tedavi edilir. Her konsantrasyon triplicate olarak değerlendirilir.
Her seyreltme için uygun parazitlerin sayısı kontrol kuyularında parazit lerin sayısı ile karşılaştırılır. Pentaminin etkileri, bir referans ilaç, insan Afrika tripsomiazis tedavisinde kullanılan bu şekilde görüntülenir. Trypanosome makrofaj co-kültürler hücresel düzeyde konak parazit etkileşimi soruşturma sağlar.
Makrofaj parazit co-kültürlerde, ekstra hücresel tripanozomlar ornitin arginin hidrolize makrofaj arginaz üretimini neden. Ornitin poliaminler ve trippanothione öncüsü, parazit sağkalım ve büyüme için gerekli. Ayrıca, arginin tükenmesi trippanocidal nitrik oksit üretimini azaltır.
Daha sonra, bir arginaz inhibitörü eklenmesi, Co-kültürlere S-L-sistein önemli ölçüde makrofaj kaynaklı parazit büyümesini azaltır. Arginaz indüksiyon trypanosome atılır ve veya salgılanan faktörler tarafından aracılık edilir. Bu arginaz indükleyen faktör bir ortinin kinesin olarak tespit edilmiştir.
Kinesin C-tipi lektin mannose bağlayıcı reseptörlerine bağlanır. Arginase indüklenen ve parazit büyüme lehine ornitin üretir. Arginaz, 12.5 milimolar mannose ile kültürlenen makrofajlarda kinezin veya makrofaj mannose reseptörlerinin silindiği farelerden makrofajlarda indüklenmez.
BILBO1 gibi yeni sitoskeletal proteinlerin tanımlandığı çalışmalarda DAEA selüloz saflaştırılmış tripozomlar kullanılarak hücre biyolojisi ve biyokimyasal deneylerin diğer örnekleri gösterilmiştir. BILBO1 önemli sitoskeletal yapıların biyogenezi ve parazit sağkalımı için gereklidir. Bu nedenle BILBO1 patojenik tripozomlara müdahale için önemli bir hedef teşkil eder.
Bir kan dolaşımı kültür formunun immünuneskence etiketleme gösteren bir görüntü, bir anti-BILBO1 antikor ile probed trippanosoma brucei hücre bu şekilde gösterilmiştir. Ayrıca, glukoz ve treonin metabolizması DEAE selüloz saflaştırılmış tripazomlar kullanılarak tanımlanmışve bu süreçlerde yer alan enzimler deneysel olarak doğrulanmıştır. Kan dolaşımı nda oluşan trypanosomes glikoz ve treonin metabolizmasının şematik bir gösterimi bu şekilde gösterilmiştir.
Aniyon değişimleri DEAE selüloz sütunları ile kandan Afrika tripomlerinin arınması, sadece endemik alanlarda düşük parazitmia sahip doğal konaklarda değil, aynı zamanda deneysel araştırmalar için çok sayıda parazit gereksinimi için de tripomtespitiçin altın standart olmaya devam etmektedir. Araştırmalar parazit sağkalım ve büyüme de önemli rol oynayan tripatri moleküllerinin belirlenmesine izin veremilmiştir. Tanımlanan hedefler, tek bir sağlık yaklaşımında hem insanlar hem de hayvanlar için potansiyel antijenlere sahip gelecekteki bir aşının temelini oluşturabilir.
