Yazarlar çocuk ve yetişkin plazma donörler ve Tıbbi Araştırma Papua Yeni Gine Enstitüsü personel teşekkür etmek istiyoruz. Yazarlar, bu tekniğin gelişmesine katkılarından dolayı Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie&#39;nin, Danny W Wilson, Ivo Mueller ve Diana S Hansen teşekkür, kan ve serum paketleri için Avustralya Kızıl haç teşekkür ederim. Bu çalışma Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapı Desteği ve Avustralya Hükümeti NHMRC IRIISS sayesinde mümkün olmuştur. Bu çalışma, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir # 1031212 ve # 637406 verir ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe # AI089686.

Not: Bütün safhalar, santrifüjleme ve akış sitometrisi yanı sıra, sterilliği korumak için, bir laminar akış başlığı içinde yapılmalıdır. Uygun önlemler insan örneklerinin kullanımı ile ilgili alınmış olduğundan emin olun. Deney Plazma küçük miktarlarda için çok hassastır. % 78 Papua Yeni Gine (PNG) yarı-immün çocukların plazma - Resim seyreltileri 5 arasında değişen tepkileri çözmek için en uygunudur. En uygun seyreltme plazma setleri, test edilen bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle, plazma, her uygulama için deneysel koşullar elde etmek için titre edilmesi önerilir. Plazma yokluğunda merozoit 2 negatif kontrol THP-1 hücreleri, ilave edilmesini temin etmek; ve merozoit ile THP-1 hücreleri, sıtma naif bireylerden plazma bir havuzu ile opsonize. Bu THP-1 hücreleri merozoit bağlılık için kontrolü sağlayacak ve fagositoz olayların titiz akım sitometri yolluk etkinleştirmek için. PNG plazma örneklerinin kullanımı olduTıbbi Araştırmalar Danışma Kurulu, Sağlık Papua Yeni Gine Bakanlığı, Walter ve Eliza Hall Institute Etik Kurulu (proje numarası 04/04) tarafından onaylanmıştır. Yazılı izin tüm katılımcıların anne / veliler elde edilmiştir. 1.. THP-1 Kültür <ol><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve 55 uM 2-mercapthoethanol (THP-1 ortamı) ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortam maddesi içinde ve 37 ° C &#39;de, insan monositik hücre hattı THP-1 koruyun. </li><li> 5 x 10 5 hücre / ml &#39;nin altındaki bir yoğunlukta hücreler koruyun. Not: Fazla büyüme yapışık hücreler içine aşağı-regülasyonu Fc reseptörleri farklılaşması ile sonuçlanır. Hücreler, yaklaşık 10 kez daha pasajlama edildikten sonra, hücre fenotipi korumak için yeni bir şişe eritin. </li></ol> 2.. Antikor Numune Hazırlama ve seyreltme <ol><li> Isı etkisizleştirilmiş plazma 56 ° C&#39;de inkübe tarafından test edilmiş ve sıtma görmemiş kontrol plazma edilecek, 30 dakika boyunca C </li><li> Seri olarak THP-1 ortamı içinde 1/2, 000 plazma örnekleri seyreltin. </li><li> -20 ° C&#39;de saklayın seyreltilmiş plazma </li></ol> Yüksek Senkronize P. 3. Kültür falciparum Not: GFP-ifade parazit hattı D10-27 PfPHG nedeniyle parazitlerin senkronizasyon ve E64 Eklemenin zamanlaması kontrol edilen yardımcı olarak 48 saat yaşam döngüsü için kullanılmıştır. Bu hat sitosolde GFP ifade çünkü Dahası, bu hat GFP akış sitometri tespiti tarafından parasitaemia ve ücretsiz merozoit algılanmasını sağlar. Bununla birlikte, GFP floresan yoğunluğu THP-1 hücreleri içinde görüntülenmesini sağlamak için yeterli değildir ve bu nedenle, merozoites Etidyum bromür (EtBr) ile karşı edilir. Diğer suşlar parazit sıkı senkron başarılabilir koşuluyla kullanılabilir. Invazyon 15 inhibe etmek için olgun formları 28 ve heparin parçalamak için sorbitol tedavinin bir kombinasyonu kullanılarak parazitler senkronize </skadar&gt;. <ol><li> P ismi koruyun falciparum RPMI-1640 ortamı içinde% 3 hematokrit 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hipoksantin,% 10 toplanmış insan serumu, 2 mg / ml sodyum bikarbonat ile desteklenmiş (pH 7.4), O + insan eritrositleri (RBC) olarak parazitleri ve 20 ug / ml gentamisin (Parazit ortamı). GFP + parazitler için seçmek üzere kültür ortamına 5 mg / ml Blasticidin-S hidroklorid ekleyin. </li><li> % 1 O 2,% 4 CO2 ve% 95 N2 atmosferinde 37 ° C &#39;de hava geçirmez kutu veya alternatif olarak çift kapalı kültür şişelerinde kültürleri inkübe edin. </li><li> , Ince bir tabaka slaytlar Hazırlama 10 saniye boyunca% 100 metanol içinde çözmek ve 6.7 mM (pH 7.1) paraziteminin izlemek için 10 dakika boyunca fosfat tamponu (Giemsa çözeltisi) içinde% 10 Giemsa çözeltisi ile lekesi. Boyama sonra, su ve hava-kuru olarak slayt durulayın. Bir 100X immersiyon yağı lens kullanarak paraziteminin değerlendirin. </li><li> Kültürleri bölme ve bulaşmamış ekleyerek% 5 enfekte RBC altında bir parazitemya az parazit kültürleri korumakRBC gerektiği gibi. </li><li> Heparin ile senkronize etmek için, kültürleri aşamalı halka tıbbi dereceli heparin 20 IU / ml ekleyin. </li><li> Parazitlerin çoğunluğu şizont aşamasında olduğunda, 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de topak hücreleri şizont yırtılması ve merozoit işgali izin vermek için bir parazit ortamında heparin içeren ortam ve tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> 4 saat sonra, başka merozoit istilasını engelleyerek, geri kültürlere 20 IU / ml heparin ekleyin. Not: parazitler yeterince senkronize önce sorbitol ve heparin tedavi birkaç devir gerekli olabilir. % 5 parasitaemia - merozoit uygun numaraları oluşturmak için, 3 de parazit kültürünün 150 ml hazırlamak. </li></ol> Geç Sahne P. 4. İzolasyonu falciparum trophozoit <ol><li> Otuz altı saat kültürlere heparin döndükten sonra, 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de kültürlenmiş hücreler pelet, ve% 25 hematokrit parazit ortam içinde tekrar süspansiyon pelet. </li><li> Geniş bir manyetik kolonu (6.3 matris hacmi takınmi) bir mıknatıs, ve tüm hava kabarcıkları bertaraf edilmiştir emin, parazit ortamı ile sütun dengeye getirin. </li><li> Yeniden süspansiyon haline P. ekleme falciparum kültürü, kolona ve saniyede bir damlasına akış hızını ayarlayın. </li><li> Kültür kolonundan geçtikten sonra akış ile net bitene kadar, parazit ortamı ile sütun yıkayın. </li><li> 37 ° C parazit ortamında 30 ml kolondan parazitleri Zehir. </li><li> , Parazitler bir ince bir tabaka hazırlanması 10 saniye boyunca% 100 metanol içinde çözmek ve 3 dakika boyunca Giemsa çözeltisi ile leke. Mikroskop altında slayt inceleyin ve parazitler neredeyse kırmızı kan hücresi, dolgu ve erken şizont dönemlerinde olduğu görünmesini sağlamak. Parazitler, uygun olgunlaşma aşamaya varsa uygun geliştirilmiş kadar,% 1 O 2,% 4 CO2 ve% 95 N2 atmosferinde 37 ° C inkübatör saflaştırılmış parazitler döndürür. Not:% 90 daha enfekte kırmızı kan hücrelerinin saflığı R sağlamak için gerekli olanBCs merozoit hazırlıklarını kontamine yok. </li><li> . 10. mcM E64 6 (epoksisukini-L-ösi (4-ganidino) bütan (E64) ile izole schizontsun davranın - 10 saat NOT: E64 ile uzun inkübasyon süreleri mümkündür, ancak üretilen merozoites artık invaziv olacaktır. </li></ol> P. 5. Izolasyonu falciparum merozoites <ol><li> E64 ile inkübasyondan sonra,% 100 metanol hücreleri düzeltmek ve zar-kapalı merozoit oluşumunu değerlendirmek için Giemsa çözeltisi ile leke, parazitler smear. NOT: parazitlerin% 50&#39;den daha fazla zar içine merozoitler meydana varsa merozoit iyi bir verim elde edilir. </li><li> Pellet 8 dakika boyunca 1900 x g&#39;de schizontsun E64-işlemden geçirildi. Kalan insan serumu çıkarmak için RT RPMI-1640 ortamında, 50 ml 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hipoksantin, 2 mg / ml sodyum bikarbonat ve 20 ug / ml gentamisin (yıkama ortamının) ile takviye edilmiş (pH 7.4) ile yıkayın . </li><li> Yıkama ortamının 2 ml pelletini. NOT: THP-1 ortam FCS içeren kullanma filtrasyon sırasında frothing üretecek. </li><li> 1.2 μm/32 mm şırınga filtresi üzerinden yeniden süspansiyon haline getirilmiş E64-schizontsun 2 ml filtre. Bir 10 ml tüp içinde süzüntüyü toplayın. Not: Süzülen filtresinde un-rüptüre schizontsun ve moloz, merozoitler ve hemozoin kristalleri içerir. </li><li> Bir mıknatıs, küçük bir manyetik sütun takın ve 500 ul THP-1 ortam ile dengelenmesi. </li><li> Manyetik sütunu üzerinde filtrat geçirin. Flow-through toplayın. Not: merozoites geçecek ise Hemozoin, kolona bağlanacaktır. </li><li> Her bir zaman içinde akışı toplamak, hemozoin kaldırmak için sütun iki kez daha fazla akım geçer. </li><li> Kalan merozoitler toplamak için RT THP-1 ortam 2 ml ile sütun durulayın. </li><li> 10 ug / ml (son konsantrasyon) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca lekesine EtBr ekleyin. Photobleaching önlemek için ışıktan korumak. Not: emin olun hepsi EtBr kirlenmiş sıvı ve pLastic atık sitotoksik kimyasalların uygun bir şekilde bertaraf edilir. Bu merozoitler, inkübasyonu takiben artık invaziv vardır. </li><li> 10 dakika boyunca 4.000 xg&#39;de merozoites aşağı spin. </li><li> Uygun bir atık kabı içine süpernatant atın. </li><li> 4 ml THP-1 ortamında merozoit pelletini ve 10 dakika boyunca 4.000 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> 15 ml&#39;lik bir hacme kadar THP-1 orta toplayın ve ışıktan koruyunuz. </li></ol> Sitometrisi 6. Nicel Merozoit Konsantrasyon <ol><li> Oda sıcaklığına kadar boncuk sayma getirin. </li><li> Merozoitler seyreltmek için% 0.5 BSA ile PBS hazırlayın. </li><li> 3 seyreltilerde merozoitler Toplamı; 100&#39;de 1; 1, 50 ve 25 1., Sırasıyla, PBS +% 0.5 BSA içinde 940, 930 ve 910 ul 3 FACS tüpü hazırlayın. Sırasıyla, tüp başına saflaştırılmış merozoit 10, 20 ve 40 ul ekle. </li><li> 30 saniye vorteksleyin sayma boncuklar, ve sulandırılmış merozoitler içeren FACS tüp başına, boncuk tanelerin 50 ul ekle. </li><li> Üç sey çalıştırınBir akış usulünde merozoit örnekleri sitometresiyle 488 nm lazer ile donatılmış. Ayrı bir kanal floresan tarafından EtBr ve GFP floresan çift floresan dayalı merozoit ve kapı sayma boncuk için sıkı bir kapı ayarlayın. 2000 boncuk toplanana kadar olayları edinin. Not: Bu talimatlar EtBr ile karşı lekelenmiş olan GFP + merozoites sayma bakın. Sonra yan dağılım ve EtBr floresan dayalı merozoit kapıları ayarlamak parazitleri ifade GFP kullanan değilse. </li><li> Merozoit oranını belirleyin: 2.000 sayma boncuk olaylar merozoit olayların sayısına bölünmesiyle boncuk, her seyreltme için bir oranını hesaplamak. Tüp başına eklenmiş boncukların 50 ul boncuk sayısını belirlemek için sayma boncuk yığın özelliklerini kullanarak. </li><li> Seyreltme faktörü ile ve merozoit 50 ul boncuk sayısını çarpın: bu seyreltme faktörü boncuk oranına sahiptir. Bu sayı, ml başına merozoit konsantrasyonuna eşittir. Inci gerçekleştirinHer seyreltme için adımlar ese. </li><li> Üç eriyiğinin boyunca ölçülen merozoit konsantrasyonları ortalama. 50 yılında 100, 1 1 için belirlenen konsantrasyonları için% 10 aşan standart sapmaları ve 1 25 sulandırmalar sayım numune hazırlamada teknik yanlışlıklar gösterir: NOT. </li><li> THP-1 hücre başına dört merozoit nihai bir oran sağlamak için, THP-1 ortamı içinde 8 x 10 6 merozoites / ml &#39;de yeniden süspanse merozoitler. THP-1 oranlarına diğer merozoit kullanılabilir ve buna göre konsantrasyonları modifiye edilmelidir: NOT. </li></ol> 7. Fagositoz Assay <ol><li> 96 U-alt plakaların kuyu başına ısı inaktif FCS 200 ul ekleyin ve plakaları engellemek için RT O / N bırakın. İnkübasyondan sonra, FCS çıkarın ve 200 ul steril PBS ile iki kez kuyu yıkayın. Kullanılana kadar 4 ° C de PBS ve mağaza plakaları çıkarın. </li><li> 1 x 10 ° numune için triplikat kuyu sağlayan, plazma örnekleri ve kontrol test etmek için gerekli olan THP-1 hücre sayısını hesaplayın <sup&gt; 5 THP-1 hücreleri, oyuk başına. </li><li> Bir hemositometre slayta kültürün 10 ul yükleyerek THP-1 kültür konsantrasyonunu belirleyin. Mikroskop altında haemocytometer 16 köşe kareler 4 set mevcut hücrelerin sayısını sayar ve ardından ortalama sayımları. Ml başına hücre sayısını hesaplamak için 10,000 ile ortalama sayısını çarpın. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de THP-1 hücrelerinin gerekli sayıda Spin ve THP-1 ortamı içinde 6.7 x 10 5 hücre / ml &#39;de tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 10 5 hücre / göz ile sonuçlanan bir FCS ile bloke edilmiş 96 oyuklu U tabanlı bir plaka için oyuk başına THP-1 ortamı içinde THP-1 hücrelerinin 150 ul ekle. Test edilecek numune başına 3 kuyu hazırlayın. Merozoites eklemek için hazır olana kadar inkübatör için plaka dönüş. </li><li> De ayrı FCS ile bloke edilmiş 96 oyuklu U tabanlı bir plaka 8 x 10 6 / ml başına en merozoit hazırlanması 150 ul ekle. Test numune başına bir kuyu hazırlayın </li><li> T, oyuk başına hazırlanmış seyreltilmiş plazma örnekleri 10 ul ekleo merozoites içeren plaka ve homojen bir çözüm sağlamak için iyice karıştırın. </li><li> Inkübatör THP-1 plaka çıkarın ve plazma, numune başına üç kopya halindeki gözlerin, iyi THP-1 hücreleri içeren her merozoit / plazma çözeltisi 50 ul ekle. </li><li> İyice karıştırın ve% 5 CO2, 40 dakika boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. Işıktan korumak için folyo ile örtün. </li><li> 40 dak, 4 ° C&#39;de 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj örnekleri fagositoz durdurmak için santrifüj önceden soğutulmuş sonra. </li><li> Süpernatantı, ve buz gibi soğuk PBS +% 0.5 BSA 2 mM EDTA (FACS tamponu) ile iki kez yıkama hücreleri. Not: EDTA akış sitometri analizi için tek bir hücre süspansiyonu korunmasında kolaylaştıracaktır. </li><li> PBS +% 0.5 BSA 2 mM EDTA (FACS sabitleyici) içinde% 2 paraformaldehit (PFA) 90 ul, hücreler. Işıktan korunmalıdır edinimi, kadar buz üzerinde bırakın. </li></ol> 8. Sitometrisi <ol><li> Donanımlı wi akış sitometresiyle örnekleri Edinme488 nm lazer ve yüksek kapasiteli plaka okuyucu eki inci. NOT: Bu bir merozoit hazırlanmasından test edilecek 400 plazma örneklerinde kadar sağlayacaktır. Hücreler, aynı zamanda el ile örnek yükleme için tüplere transfer edilebilir. </li><li> Ileri ve yan dağılım tarafından Kapısı canlı THP-1 hücreleri. </li><li> Kontrol &#39;merozoit ve hiçbir plazma ile THP-1 hücrelerinde&#39; dayalı EtBr olumlu kapıyı ayarlayın. </li><li> Örnek başına 10.000 olayların en az edinin. </li></ol> 9. Veri Analizi <ol><li> Analiz yazılımı akım sitometri ve EtBr olumlu olaylar için sıkı kapıları ayarlamak kullanarak verileri analiz. </li><li> Immün olmayan bir plazmadan ile örnek eksi% pozitif hücreler için EtBr + hücrelerin%: Her numune için yüzde fagositoz hesaplayın. </li><li> Kopyalardaki genelinde ortalama sonuçları. NOT:% 10 aşan bir üçlü için standart sapmalar deneysel yanlışlıklar göstermektedir. Bazı arka EtBr pozitif olaylar merozoi bir sonucu olarak gözlenebilirte THP-1 hücrelerinin yüzeyine yapışma fakat merozoitler içeren tüm numuneler arasında tutarlı olmalıdır. Daha sonra denetim &#39;THP-1 merozoit ve herhangi bir plazma ile hücreler&#39;, ve kontrol &#39;non-immün plazma ile THP-1 hücre&#39; içinde herhangi bir arka plan çıkarılması göre kapı ayarlama nedeniyle içsel için floresan yansıtan% fagositoz neden olur / Sadece merozoites fagosite. </li></ol>

<ol>
	<li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria.">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li><li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G., Medicine, P. L. o. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+anti-merozoite+antibodies+and+incidence+of+Plasmodium+falciparum+malaria:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Medicine. 7, (2010).</li><li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro,+but+act+in+cooperation+with+monocytes.">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li><li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII.">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, 3099-3106 (1950).</li><li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea.">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li><li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine.">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li><li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome.">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li><li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria.">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72 (2007).</li><li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection.">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria.">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies.">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry.">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li><li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development.">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte:+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis.">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li><li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development.">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li><li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum.">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li><li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite.">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte.">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite.">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion.">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li><li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture.">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li><li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+immunity+to+malaria.">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites.">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria.">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays.">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152 (2010).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase.">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li><li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms.">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li><li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa.">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li><li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals.">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li><li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line.">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li><li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Merozoit fagositoz ölçmek için, iki teknik uzmanlık gereklidir: merozoit ve THP-1 deneyinde fagositoz saflaştırılması. Bu iki tekniklerini birleştirerek için en kritik adımlar şunlardır: 1) Yüksek senkronize parazitler; 2) zar içine merozoitler vermek üzere, doğru zamanda E64 eklenmesi; 3) agrega önlemek için hemozoin Çıkarma; Akım sitometri 4) Doğru merozoit sayma; 5) kullanılan plazma seyreltme; ve 6) düşük hücre yoğunluğu ve THP-1 hücrelerinin geçiş sayısı elde. Bu önemli yönlerinden dikkatli dikkate sağlam fagositoz tepkileri gözlenir sağlayacaktır. Burada açıklanan rağmen, fagositoz değerlendirmek için merozoit hazırlanmasıdır, bu teknik geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılabilir. Bağımsız olarak alt akış metodoloji, uygun merozoit preparasyonlar doğru merozoitler üretmek amacıyla E64 ilave zamanlama bağlıdır. Burada açıklanan yöntem E64 y gösterilmiştirişgali olayları ve ilaç duyarlılık deneyleri 15-20 yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanım için invaziv merozoites ield. Merozoit canlılığı fagositoz için gerekli olmasa da, merozoit yüzey kaplamanın bütünlüğü gereklidir. Bu nedenle, burada açıklanan yöntem E64, yüksek kaliteli merozoites yüzey kaplamak için antikor tepkileri değerlendirilmesi için üretilecek sağlar. E64 çok erken ilave edilir ya da çok geç zar içine merozoites oluşmadığı takdirde, Şekil 1 &#39;de belirtildiği gibi. Bu nedenle, yüksek derecede uyumlu parazit kültürlerinin gerekmektedir. Burada, sıkı için sorbitol ve heparin tedavilerin kullanımı 2 saatlik bir pencerede D10-GFP parazit senkronize kültürleri tarif edilmektedir. Heparin diğer laboratuvar izolatının gametocytogenesis teşvik edebilir ve bu nedenle dikkatle kullanılmalıdır. Örneğin alanin gibi alternatif yöntemler de sıkı bir senkronizasyon senkronize parazitler 29 üretilir kaydıyla, kullanılabilir. E64 uyumsuz parazit ilave edilirse, bir alt pervanezar-kapalı merozoit bir ortion üretilen ve kalan RBC normal kopma veya anormal morfoloji gelişecektir ya parazit bulaşmış olacaktır. Membran kapalı merozoit haline olmayan parazitlerin varlığı filtrenin tıkanması ile sonuçlanabilir ve önemli ölçüde elde merozoit randımanını azaltacaktır. Zara-kapalı merozoit filtrasyonu sırasında, hemozoin sindirim vakuoller gelen serbest kalır ve çözelti içinde serbest kristaller olarak bulunur. Hemozoin yüksek proenflamatuar ve monosit ve makrofaj fagositoz yanıtları 30, 31, modüle etmek için rapor edilmiştir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, fagositoz modüle ek olarak, çözelti içinde hemozoin merozoit ile agregalar oluşturabilirler. THP-1 hücreleri, bu agrega fagosite gibi, bu antikor aracılı fagositoz çözünürlüğü için önemli bir karıştırıcı faktör olabilir. Bu nedenle, hemozoin çıkarılması av için bu tahlilde gereklidirphagocyte biyoloji hemozoin arasında oid ek karmaşıklık. Merozoit miktar gerekli olduğu durumda, diğer uygulamalar için serbest merozoitler oluşturmak için bu tekniği kullanarak Buna ek olarak, hemozoin kaldırmak yetmezliği de zararlı olabilir. Şekil 4 &#39;de belirtildiği gibi, merozoit sayısı, THP-1 hücreleri tarafından fagositoz derecesini etkileyebilir tahlile eklenir. Akım sitometri merozoit konsantrasyon, dikkatli pipetleme ve merozoit sayımlarını çoğaltmak sayımı için izin verse doğruluğunu geliştirmek için gereklidir. Birden çok parazit satır yan yana test edilecek olan, bu özellikle önemlidir. Daha önce yanıtları 23 çevirmeden önce PNG yarı bağışıklık çocuklardan plazma önemli ölçüde seyreltilebilir olduğu gösterilmiştir. Phagocyt en geniş bir ürün yelpazesi üretilir 12 yaşındaki çocuklar PNG - 5 in bir grup için plazmanın optimum seyreltme (1/120, plazmanın 000 nihai seyreltme) burada tarif. (-% 19, 20 -% 39, 40-59 ve% 60 - 0% 79 fagositoz) Şekil 5&#39;te açıklanan osis tepkiler Bu dizi dört gruba tepkilerin tabakalaşma için izin ve regresyon modelleme opsonizing tepkiler ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur Farklı kohort için klinik hastalığı ve yüksek yoğunluklu bir parazitemya 10 korunma veya saptama seviyesinin altında doymuş değildir bu THP-1 hücreleri ile fagositozu sağlamak için plazma dilüsyonu ayarlamak gerekli olabilir çalışmaları. Akım sitometri mikroskobu üzerinde geliştirilmiş doğrulukta hızlı ve ölçülebilir fagositozisi sağlar. Bu protokol, yüksek verimlilik, plaka temelli ve doğal olarak elde edilen humoral bağışıklığı incelemek için, 96 gözlü levhalar yakalanmasını otomatiktir. Yöntem, SYBR @ Green, DAPI ve propidyum iyodin, zar ya da protein lekeleri gibi lekeler bununla birlikte alternatif bir DNA lekeleri yararlanılabilir, etidyum bromür ile merozoit boyanmasını gerektirir. Bu tahlil PRIMAR mükellef olacaktırphagocyte veya FcR biyoloji ilgi ise y monositler ya da nötrofiller ve adapte edilebilir. PMA ile in vitro farklılaşan Birincil hücreler ya da THP-1 hücreleri, sıtma ve diğer patojenlerin 12, 32-34 fagositoz incelemek için kullanılabilir. Bu hücrelerin yapışık ve aynı zamanda non-antikor aracılı fagositoz 35 ekran gibi ancak primer hücreler kullanılarak zor olabilir. Buna ek olarak, saflık, canlılığı ve fonksiyonelliği değişkenlik primer fagositik hücrelerin kullanımı için bazı temel sınırlamalar vardır. Merozoit fagositoz dahil Fc reseptörleri uncharacterized kalır ve bu nedenle belirli bir Fc reseptörleri bloke edici antikor fagositoz merozoit için her bir Fc reseptörünün katkısını aydınlatmak olabilir kullanılmıştır. THP-1 fagositoz FcR bağlı olduğu için, bu gözlenen fagositoz basit yorumu sağlar. Bu deney aynı zamanda util ile elde edilebilir opsonizing antikorların antijen özgüllüğü ele için oldukça rahatmerozoit yüzey antijenleri için knock-out parazitleri izing veya yüzey proteinleri merozoit için afinite saflaştırılmış insan antikorları kullanılmıştır. Ayrıca, derinlik merozoit fagositoz aşağıdaki sitokin tepkilerinin çalışmalar yoktur ve bu deneyi kullanılarak elde edilebilir. Bu iki teknik fonksiyon antimerozoite antikorların çalışma önemli gelişmeler oluşturmaktadır. Yüksek kaliteli merozoit saflaştırılması dondurularak saklanmış merozoitler veya merozoit antijeni ile kaplanmıştır flüoresan mikro küreleri kullanarak avantajlıdır. Bu deney, doğal olarak kazanılmış bağışıklık değerlendirmek için bir araç olarak kullanılmış olmasına rağmen, bu aşılamaya yanıt olarak bağışıklık kazanılmasını adresleme için önemli bir araç olduğu kanıtlanabilir. Son zamanlarda fagositoz veya opsonised merozoites klinik sıtmadan korunma ile ilişkili olduğu gösterilmiş olsa da, in vivo phagocyto için in vitro THP-1 fagositoz doğrudan bir sonuç çıkarmak mümkün değildirBu analizde fagositoz gibi merozoit arasında sis statik koşullar altında ve kırmızı kan hücrelerinin rekabet yokluğunda meydana gelir. Bu tahlilin potansiyel uyarlamalar, böylece sıtma ve merozoit fagositoz daha iyi anlaşılması için bir çok yönlü bir araç sağlayabilir.

Plasmodium falciparum sıtma karşı bağışıklık için antikorların önemi 40 yıl önce, hiper-yetişkinlerden immünoglobulin zaman pasif hafifletilen hastalık 1 &#39;de elde edilen ciddi sıtma hastası çocukların aktarılmıştır gösterildi. Sonuç olarak, önemli çaba çoğunlukla ELISA ile peptitler veya bakteriyel proteinlere antikor titreleri ölçme yoluyla, koruyucu sıtma bağışıklığın hedefler belirlemeye çalışmıştır. ELISA tabanlı seroloji de çalışmalar arasında oldukça değişken olduğunu kanıtlamıştır, ve antikor işlevselliği 2 gidermez. Birçok sıtma antijenleri, cytophilic IgG1 ve IgG3 antikor profili, özellikle de merozoit yüzey antijenlerini 3 neden olur. Bu alt sınıf, bias fagositlerle antikor-Fc-reseptörü (FcR) etkileşimleri antimerozoite antikorların 4 opsonizing efektör fonksiyonlar için önemli olduğunu göstermektedir. Geliştirilmekte olan çeşitli merozoit antijen aşıları için tasarlanmıştırfagosit efektör fonksiyonları 5, 6 ve ortaya kemirgen sıtma modellerinde antikor FcR etkileşimlerinin önemi için önemli kanıtlar mevcut 7-9 ve birkaç son çalışmalar insanlarda sıtmaya karşı bağışıklık için, fonksiyonel antikor ve fagosit efektör fonksiyonlarının önemini destek rağmen 10, 11, bu alanda kötü okudu kalır. Merozoit özel opsonizing antikorların içine Çalışması iki faktör ile sınırlı kalmıştır; kaliteli merozoites tecrit içinde zorluk; primer hücrelerden ve değişken fagositoz yanıtları. Yakın zamana kadar, yüksek hızlı santrifüjleme ya da Percoll yoğunluk gradyanları şizont kültürleri yırtılma kültür süpernatanlarından merozoitler izole etmek için kullanılmıştır. Bu merozoites nadiren uygun olan ve genellikle daha fazla yoğunluk santrifüj ile manipüle ve birden çok yıkama tahlillerinde kullanımdan önce 12 veya kriyo-korunmasının 11 adımları tekrarlayın. Bu processes potansiyel merozoit yüzeyinden birçok periferik ilişkili proteinleri, sıtma dokunulmazlık 13 antijenik hedefler olarak bilinen proteinleri ayırmak. Son zamanlarda, sistein proteaz inhibitörü trans-epoksisukini-L-ösi (4-guanidino) bütan (E64) uygun bir merozoitler oluşturmak için kullanılmıştır. E64 uygun merozoitler 15, 16 serbest bırakmak için süzme ile bozulabilmektedir zar kapalı merozoitler 14, üreten, şizont kopma önler. Bu teknik eritrosit işgali 15, 17-19 sırasında çok sayıda proteinlerin mekansal çözünürlükte yol açtı ve birkaç antimalarialların 16, 20 sahne özgü etkisini netleştirdi. Ancak, canlı merozoit nesil teknik açıdan zorlayıcı kalır. Bağışıklık ile ilgili işlevsel deneyler, bir viyabl merozoit saflaştırma ve bunların kullanımı için ayrıntılı bir protokol için bu tekniğin ve uygulamanın yayılması yardımcı olmak içinantikor standart fonksiyonel deneyi: opsonitasyonunu ve fagositozu hücresel işbirliği burada tarif edilmektedir. Bu teknik, nötrofil solunum patlamasının, antikor bağımlı hücresel İnhibisyonu (ADCI) ve alternatif merozoit fagositoz tahlilleri gibi merozoit opsonitasyonunu önceki in vitro deneylerde, üzerinde önemli bir gelişmeyi gösterir. Bu analizler parazit girişler varyasyonun ve primer fagositik hücreler 11, 21 aktivitesine kötü tekrarlanabilir. Kirlenmesine hemozoin da derinden phagocyte fonksiyonunu 22. etkileyebilir. Bir son bildirilen sağlam ve tekrarlanabilir merozoit fagositoz deney 23 promonositik hücre hattı THP-1 24 kullanır. Bu yapışkan olmayan ve spesifik olarak Fc-reseptörü aracılığıyla olan fagositozla 25, 26 yerine olarak bu yüksek işleme kapasiteli bir akış sitometri analizleri için ideal bir hücre türüdür. Ek bir karmaşıklık araş ikenfagositoz tigating fagositoz derecesi THP-1 hücreleri ve plazma konsantrasyonu göre merozoit sayısına bağlı olmasıdır. Deneyler arasında yeniden üretilebilirlik sağlamak için, merozoites numaralandırılmış olmalıdır ve belli bir konsantrasyonu kullanılır. Nedeniyle küçük boyutu, sıtometrık ölçümü gereklidir akış. Burada tarif edilen prosedür hemozoin kaldırır ve uygulanabilir merozoitler oluşturur ve opsonitasyonunu ve fagositozu ve ardından merozoit akış sitometrik sayımı için, bu merozoit bir uygulamasını tarif etmektedir. Teknik olarak zor olmasına rağmen, açıklanan teknikler doğal olarak elde edilen ve aşı bağışıklık kaynaklı için merozoit yüzey özgü antikor yanıtlarının katkı açıklık de yararlı olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">THP-1 cell line</td>
			<td style="width:225px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31800-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercapthoethanol&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td>Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pen/Strep Solution (100x)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">90909C</td>
			<td style="width:373px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Donation from Autralian Red Cross</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamycin</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">61022027</td>
			<td style="width:373px;">Injection Quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin Sodium BP (5000IU/mL)</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>procine origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S-hydrochloride</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-sorbitol</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">&#160;50-70-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E64 Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">98281-100G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4.2H20</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10383.4G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:317px;">Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.09204.0500</td>
			<td style="width:373px;">1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrodisc Syringe Filters 1.2-&#956;m/32-mm</td>
			<td style="width:225px;">Pall Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">QuadroMACS Separator (for small column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td>Interchangeable with MidiMACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">VarioMACS Separator (for large columns)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-090-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Column (small magnetic column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">large magnetic column</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1510433</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:225px;">Invitogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td>
			<td style="width:225px;">BD Biopsciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">FlowJo cytometry analysis software</td>
			<td style="width:225px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

Plasmodium falciparum merozoit antijenler potansiyel sıtma aşıları gibi geliştirilme aşamasındadır. Sıtmaya karşı bağışıklık bir özelliği, fagositik hücreler tarafından kandan serbest merozoit kaldırılmasıdır. Bununla birlikte, belirli merozoit opsonizing antikorlarının fonksiyonel etkinliğini değerlendirmek nedeniyle merozoit kısa yarılanma ömrü ve primer fagositik hücrelerin değişkenliği nedeniyle zordur. Ayrıntılı olarak açıklanmıştır, burada E64 proteaz inhibitörü kullanılarak uygulanabilir merozoitler üretilmesi için bir yöntem ve pro-monositik hücre hattı THP-1 kullanılarak merozoit bir deney opsonin bağımlı olduğunu fagositoz. Tedavi schizontsun süzülerek yayımlanan merozoit gelişimini sağlarken E64 şizont rüptürü önler. Etidyum bromür etiketli merozoites insan plazma numuneleri ile opsonize ve THP-1 hücrelerine ilave edildi. Fagositoz standart bir yüksek verimli protokolü ile değerlendirilir. Canlı merozoites numer değerlendirmek için değerli bir kaynaktırP. lı yönleri Bağışıklık fonksiyonunun değerlendirilmesi dahil falciparum biyoloji,. Bu deneyi ile ölçülen antikor seviyeleri doğal maruz kalmış bireylerdeki sıtma klinik bağışıklık ile ilişkilidir. Tahlil, aynı zamanda aşının neden olduğu antikorları değerlendirmek için yararlı olabilir.

E64 önce tedaviye parazitlerin olgunlaşma aşaması zarla kapalı merozoitler üretilmesi için çok önemlidir. Şekil 1Ai E64 ekleme schizontsun uygun olgunlaşma safhasını göstermektedir. Parazitler büyük olması ve hemen hemen kırmızı kan hücresi doldurmalıdır. Giemsa lekesi bir benekli görünüm merogoni başlamıştır gösterir ve E64 membran kapalı merozoitler (Şekil 1Aii) elde etmek için ilave edilmelidir. E64 aşama parazitleri trophozoite için daha önce ilave edilirse, zar içine merozoites da E64 12 saat sonra oluşturulmaz. Bunun yerine parazitler gibi sindirim vakuol (Şekil 1Bi ve 1Bii) büyümesi gibi anormal morfoloji almak ve merozoites oluşmuş değildir. E64 schizontsun için daha sonra ilave edilirse şizont kopma (Şekil 1CI ve 1Cii) sınır tanımayan olduğu gibi, membran-kapalı merozoites oluşturulmaz. Parazit senkroninin yüksek düzeyde gereklidir, diğeraçıklanan tüm üç sonuçların bilge bir dizi E64 tedaviden sonra görülecektir. Hemozoin çıkarılması arındırıcı merozoit için başka önemli bir adımdır. Merozoites hemozoin saflaştırılan değildir sonra merozoit-hemozoin kümeleri pipetleme yerinden edilemeyen oluşturur. Bu agrega akış sitometrisi (Şekil 2A) ile eksik merozoit sayımı ile sonuçlanan tek merozoit farklı ileri saçılma ve yan saçılma özellikleri ile de olsa, tek bir olay olarak sitometre üzerinde çalışır. THP-1 hücreleri de hemozoin fagosite gibi, bu merozoit-hemozoin kümeleri de (Şekil 2B) fagosite edilebilir. Birden çok merozoitler içeren olarak bu son derece EtBr floresan gruplar bulunmaktadır. Tek tek merozoit fagositozu için gözlenene bir THP-1 EtBr floresan profil eşdeğer agrega sonuç fagositoz. Hemozoin kaldırılmaz Bu yüzden, eğer, THP-1 hücrelerinin EtBr floresan bir o olacaktest edilen plazma opsonizing potansiyeli verestimate. Hemozoin da önemli ölçüde fagosit işlevi değiştirmek için bildirilmektedir. GFP pozitif merozoites karşı THP-1 hücreleri tarafından fagosite merozoit görselleştirme geliştirmek için EtBr ile boyanır. Bu protokolde tarif edilen koşulları kullanarak, tüm GFP pozitif merozoites parlak bir floresans yoğunluğunu (Şekil 3A) sahiptir EtBr ile karşı edilir. EtBr floresan tarafından fagosite değerlendirme GFP floresan (Şekil 3B) daha merozoit fagositozun üstün çözünürlük sağlar. Tayin sırasında ilave edilen merozoit sayısı gözlenen fagositoz miktarını modüle edecektir. Bu nedenle, akış sitometrisi ile, doğru sayım kritiktir. Merozoit oranlarını arttırmak: THP-1 plazma yokluğunda THP-1 hücrelerine merozoit artan yapışması (Şekil 4A) neden olur. Merozoit Artan: THP-1 oranları da artan pH ile sonuçlanıragocytosis tepkiler merozoites (Şekil 4B) opsonize olduğunda. 04:01 A merozoit: THP-1 oranı sağlam fagositik yanıtları için tavsiye edilir. Bu oran ve gösterilen plazma dilüsyonu kullanarak, bu deney opsonizing antikor, düşük, orta ve yüksek düzeyde açıklığa kavuşturmaktadır. 0 ila 78 oranında fagositoz tepkileri PNG plazma örnekleri ve tarif edilen diğer koşullar kullanılarak gözlenmiştir. Bu tür tepkilere; son. Şekil 5, PNG bireylerden fagositoz yanıtların 4 kuvartilleri örneklerini gösterir sıtma 10 için doğal olarak elde edilen klinik bağışıklık ile ilişkilendirmek için gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> E64 Ayrıca Şekil 1. Zamanlama zara kapalı merozoitler üretilmesi için çok önemlidir. (A) uygun maturatio. E64 olgunlaşmamış parazit eklendiğinde ise n i) E64 önce tedaviye parazitlerin aşaması ve ii) E64 tedavi 6 saat sonra üretilen membran kapalı merozoites (B) zar içine merozoites oluşturulan değildir; i) geç evre trofozoitleri ve E64 geç schizontsun parçalı eklenir ise ii) E64 12 saat sonra, (C) şizont yırtılma inhibe değildir.; i) geç evre schizontsun, ve ii) E64 6 saat sonra. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2,. Hemozoin çıkarma hemozoin manyetik merozoit ayrılır edilmiştir. Merozoit-hemozoin agrega membran kapalı merozoit filtrasyonu aşağıdaki biçimde tek hücreli merozoit süspansiyonu oluşturmak için çok önemlidir. (A) merozoit arasında ileri saçılma ve yan saçılma grafikleri ile hemozoin kaldırıldıve hemozoin korudu. (B) Hemozoin-merozoit agrega THP-1 hücreleri tarafından fagosite edilebilir. PNG plazma ile kuluçkaya THP-1 hücrelerinin Diff-Quick lekelenmiş sito-spin slaytlar hemozoin olan veya olmayan merozoit preparatlar opsonize. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3,. Etidyum Bromür boyama (A) GFP pozitif merozoit üzerinde gating ile saflaştırılmış merozoit arasında histrogram akış sitometri. D10-GFP saflaştırılmış merozoites floresan yoğunluğunu artırmak için EtBr ile karşıt edilir. Merozoit fagositoz üstün çözünürlük sağlar ve EtBr gösteren bir dot blot Bu kapı GFP pozitif nüfus içinde floresan. (B) GFP karşı İleri dağılma ve GFP ve EtBr ikili floresan merozoit fagositozuyla aşağıdaki THP-1 hücrelerinin EtBr karşı ileri dağılım. Gates, d edildi<html> Rawn merozoit ve herhangi bir plazma kontrolü ile THP-1 hücrelerine göre. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4 merozoit:. THP-1 oranı gözlenen fagositoz derecesini etkiler. (A) Beş merozoit: THP-1 oranları tasvir edilmektedir; 50:1, 20:1, 10:01, 04:01, 01:01. Hücreler tek kontrol nedeniyle THP-1 hücreleri arka plan floresan gösterir. . Her bir oranı için, THP-1 EtBr floresan (B) Farklı merozoit için THP-1 hücrelerinin ortalama florasan yoğunluğu PNG plazmanın bir havuzu ile ya da immün olmayan Avustralya plazma ile opsonize merozoit endikedir: THP-1 oranı ve bir havuz ile opsonizasyon PNG plazma veya nonimmun Avustralya plazmanın (ortalama ± SEM) arasında. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Opsonizing bir antikor büyük bir aralık ölçülebilir. Merozoitler PNG bireylerden plazma ile opsonize ve THP-1 hücreleri ile inkübe edildi. Dört temsilcisi fagositoz tepkileri gösterilmektedir. Gates, merozoit ve hiçbir plazma kontrolü ile THP-1 hücreleri dayalı çizilmiş ve sayılar non-immun plazma kontrolü ile THP-1 hücrelerinin çıkarıldıktan sonra% fagositozunu işaret edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays at JoVE.com

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Antikor fonksiyonu Ölçme Plasmodium falciparum sıtma dokunulmazlık anlamanın anahtarıdır. Bu yöntem, uygun bir merozoit saflaştırılmasını ve akış sitometresi ile opsonizasyon bağımlı fagositoz ölçümünü açıklamaktadır.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

22.8K Görüntüleme.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  Antikor fonksiyonu Ölçme Plasmodium falciparum sıtma dokunulmazlık anlamanın anahtarıdır. Bu yöntem, uygun bir merozoit saflaştırılmasını ve akış sitometresi ile opsonizasyon bağımlı fagositoz ölçümünü açıklamaktadır. 

Video: High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü<em&gt; Plasmodium falciparum</emBir kaynak Poor Setting&gt; ile enfekte Eritrosit

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Ayrılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla&gt; Geç Evre-enfekte Eritrositler

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Electrochemiluminescence deneyleri için insan adacık otoantikorlar

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...