Bu araştırma (grant 13031) ve bu eser desteklemek için CRUK Manchester biyolojik kaynak birimi, görüntüleme ve Sitometresi ve moleküler biyoloji core imkanları finansman için Bloodwise teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf">https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf</a> (2017)</li><li>. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf">https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf</a> (2017)</li><li>Liu, Y., Zeng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+and+Innate+Immune+System+Interactions:+Translational+Potentials+for+Cancer+Immunotherapy.">Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (4), 299-308 (2012).</li><li>Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+cancer+metastasis:+friend+or+foe.">The immune system in cancer metastasis: friend or foe.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79 (2017).</li><li>Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+System+in+Cancer+Pathogenesis:+Potential+Therapeutic+Approaches.">The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).</li><li>Vinay, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+in+cancer:+Mechanistic+basis+and+therapeutic+strategies.">Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies.</a> Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).</li><li>Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Suppression+in+the+Tumor+Microenvironment.">Immune Suppression in the Tumor Microenvironment.</a> Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).</li><li>Munn, D. H., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+suppressive+mechanisms+in+the+tumor+microenvironment.">Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment.</a> Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).</li><li>Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+spreading+in+immune-mediated+diseases:+implications+for+immunotherapy.">Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).</li><li>Hardwick, N., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+spreading+contributes+to+effective+immunotherapy+in+metastatic+melanoma+patients.">Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients.</a> Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).</li><li>Makkouk, A., Weiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Immunotherapy+and+Breaking+Immune+Tolerance-New+Approaches+to+an+Old+Challenge.">Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge.</a> Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).</li><li>Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD8(+)+T-cell+tolerance+for+cancer+immunotherapy.">Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphodepletion+and+tumor+burden+govern+clinical+responses+in+patients+with+B-cell+malignancies+treated+with+autologous,+CD19-targeted+T+cells.">Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells.</a> Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534 (2011).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+persistence+of+adoptively+transferred+autologous+CD19-targeted+T+cells+in+patients+with+relapsed+or+chemotherapy+refractory+B-cell+leukemias.">Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias.</a> Blood. 118 (18), 4817 (2011).</li><li>Hay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+Biomarkers+of+Severe+Cytokine+Release+Syndrome+after+CD19+Chimeric+Antigen+Receptor-modified+T+Cell+Therapy.">Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy.</a> Blood. 130, 2295-2306 (2017).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+CD19+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+treatment+of+B+cell+malignancies+in+phase+I+clinical+trials:+a+meta-analysis.">Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).</li><li>Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19+CAR+T+Cells+Expressing+IL-12+Eradicate+Lymphoma+in+Fully+Lymphoreplete+Mice+through+Induction+of+Host+Immunity.">CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).</li><li>Engels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+high-level+transgene+expression+in+T+lymphocytes.">Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes.</a> Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).</li><li>Parkinson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Necropsy+and+Selected+Tissue+and+Sample+Collection+in+Rats+and+Mice.">Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).</li><li>Kueberuwa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7(+)+selected+gene-modified+T+cells+maintain+a+central+memory+phenotype+and+display+enhanced+persistence+in+peripheral+blood+in+vivo.">CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).</li></ol>

David Gilham araba T hücrelerinin üretiminde yer Celyad için çalışır. Yazarlar kalan ifşa etmek hiçbir şey yok.

Syngeneic fare modelleri hastalık ilerleme ve terapi test sağlam bir bağışıklık sistemi koruyarak sağlar. Bağışıklık sistemi ve özellikle immunotherapeutic maddeleri için etkileşim tedaviler gelince bu her şeyden önemlidir.
Burada açıklanan protokol iki kritik iş akışı var., ilkini genetik olarak fare T hücre arabalar hızlı değiştirme. Bu başlangıç itibaren 7 gün iletim doğrulama gerektirir. Farelerde sistemik lenfoma araba T hücrelerinin üretimi ile eşlik eden bir tesistir. Araba T hücre üretim başarısız veya kalite varlık genellikle fareler önce yedek hücreleri üretmek için yeterince zaman kalmadı yetersiz Lenfoma için ölmek gerekir. Bu nedenle araştırmacılar bu modeller doğru bir şekilde kullanarak başarılı bir şekilde tedavi yönetimi için araba T hücrelerinin üretimini zaman için tümör dozaj ve hastalık ilerleme çalışmaları gerçekleştirmek çok önemlidir.
Düşük T-hücre iletim verimliliği için tipik nedenleri yapımcı hücreleri, genellikle yoksul plazmid saflık ya da yanlış transfection ortam pH tayini neden zavallı transfection verimliliğini içerir. Bu zavallı transfection T hücre iletim verimliliği sınırlar gibi tam protokolü ile devam etmeden önce yapımcı hücre transfection verimliliğini kontrol etmek için tavsiye edilir. Rekombinant insan fibronektin parçaları toplanabilir ve -20 ° c yeniden kullanmak, ancak, birden çok donma-thaws sonucunda düşük iletim verimliliği depolanan. Koleksiyonu da yüksek almak için önemlidir sonra fare dalağı hızlı işleme uygun T hücrelerinin verir.
Burada açıklanan protokol A20 hücre luciferase ifade kullanır belirtmek gerekir. Sistemik tümör yükünü bioluminescence görüntüleme tarafından ölçmek için yeteneği sağlar bu tercih edilir. Ancak, işlevsel bir bağışıklık sistemi huzurunda luciferase yanıt sonuçları çarpık. Fare işaretçisi transgenes17hayatta kalma bağışıklık tepkileri daha önce test ettik. Bunu doğrulamak için A20 hücre transgenes ücretsiz kullanarak anahtar deneyler çoğaltmak için o bunlar bağışıklık hücreleri tarafından tümör imha içinde önemli bir rol oynamak yok anahtarıdır.
Klinik ajanlar-ebilmek biricik var olmak kullanılmış içinde vivo bağışıklık eksikliği farelerde iken fare araba T hücreleri fare kanser hücrelerine karşı kullanımı tedavi edici etkinliği veya hastalık ilerlemesi için bağışıklık sisteminin katkıları değerlendirmek için bize izin verir. Bu iletişim kuralı B hücreli lenfoma veya diğer arabalar salgı IL-12 burada açıklandığı gibi ek değişiklikler ile hedefleme arabalar önceden klinik değerlendirilmesi için yararlanılabilir. Bu bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi syngeneic fare modellerinde değerlendirilebilir olmasına rağmen onlar doğru insanlar içinde vivoetkileşiminde özetlemek değil olduğunu belirtmek gerekir. Özellikle dikkat, insan ve fare araba hangi aşağı akım sonuçlara yol açabilir yapısında değişiklik gösterir; T hücrelerinin büyüme için uygun harekete geçirmek ve hücre kültür koşulları farklı20, doku dağıtım hedef antijen ifade insanlar ve fareler arasında değişiklik gösterebilir ve deneyimli toksisitesine kökten farklı olabilir. Bu nedenle ex vivo ve sonuçları teyit için xenogeneic modelleri kullanmak esastır.
Özet olarak, syngeneic lymphodepleted ve lymphoreplete modeli lenfoma hastaları ve önceki kemoterapi/radyoterapi olmadan özetlemek. Bu hangi ile yeni bağışıklık terapisi ajanların dalga önümüzdeki önemli olacaktır tedavi stratejileri bir dizi test izin vermek için klinik ayarları taklit etmek bir model sistemi sağlar.
Ön Klima kullanımı ile tüm fareler genellikle lenf kanserini temizleyin belirtilecektir. Kadar % 90 tam yanıt oranları, insanlarda bu temsilcisi etmektir. Ancak, sorunlar CD19 araba T-hücre tedavisi için çabaladıkça gözlenen yüksek frekans önlenmesi üzerinde menteşe çoğu zaman CD19 vardır. Çabaladıkça bu modelde en fazla ve genellikle 100 günden fazla gözlenmiştir değil. Değişiklik klinikte görülen çabaladıkça taklit CD19 araba T-hücre tedavisi gelecekteki sorunları ile yardımcı olabilir.

Chimeric antijen reseptör (araba) T-hücre tedavisi CD19 tedavisinde şaşırtıcı klinik başarı göstermiştir+ tisagenlecleucel Relaps Akut lenfoblastik lösemi1 ve axicabtagene için onaylanması için önde gelen maligniteler ciloleucel ilerici büyük B hücreli non-Hodgkin Lenfoma için2 2017.
Kanser ve bağışıklık sistemi hastalığı ilerleme ve tedavi mekanizmaları arasındaki etkileşimler önemi giderek tanınan3,4,hale geliyor5. Örneğin, iyi tümör microenvironment (TME) suda yüzen bağışıklık hücreleri6,7,8efektör fonksiyonları önleyebilirsiniz faktörleriyle olduğu belgelenmiştir. Alternatif olarak astar endojen bağışıklık hücreleri ve epitope yayılan tümör ortadan kaldırılması ve uzun vadeli direnci tümör meydan9,10anahtar olabilir. Bu olayların her ikisi de bir bağışıklık sistemi eksikliği xenogeneic modellerinde değerlendirilemez. Aynı şekilde, transgenik proteinler kullanan sistemleri11,12yayılan epitope için gerekli olan bağışıklık toleransı kırma meydan doğru bir şekilde yansıtmıyor. Syngeneic manken tamamen işlevsel bir bağışıklık sistemi, bu nedenle, kanser hastalığı ilerleme ve bağışıklık tedavi bu önemli yönleri modelleme için her şeyden önemlidir.
Araba T-hücre tedavisinin önemli bir uyarı lymphodepleting öncesi Klima tedavi başarı13,14için gerekli olmasıdır. Bu genellikle hastalarda infüzyon araba T hücreleri15,16önce kemoterapi yönetmek olarak elde edilir. Standart bir yöntem, hasta ayarlarında kullanılan lymphodepletion taklit etmek için bizi 5 Gy tüm vücuda radyasyon vermeliyiz (TBY) lymphodepletion sistemik A20 B hücreli lenfoma taşıyan fareler için tedavi edici araba T hücrelerinin yönetim önce ulaşmak için yönetmek.
Lymphodepleting öncesi Klima hastaların çoğu için bir sorun olmasa da, kemoterapötik ajanlar ile gelir toksisitesi düşük performans durumu hastaların araba T-hücre tedavisi için uygun değildir anlamına gelir. Lymphodepletion için uygun olmayan hastalar temsil eden bir test sistemi oluşturmak için hangi biz araba T-hücre tedavisi lenfoma model bir lymphoreplete syngeneic fare modeli kurduk. Bu modelde, biz IL-12 den salgı araba T hücreleri içinde kurulan lenfoma eradikasyonu ile başarı oranı neden olabilir gösterdi ~ % 2517. Ayrıca, endojen bağışıklık hücreleri kanser eradikasyonu dahil gösterdi.
Burada biz ayrıntılı olarak fare araba T hücrelerinin üretimi için protokol syngeneic fareler ve araba T hücreleri ile veya lymphodepleting öncesi Klima kullanımı olmadan lenfoma tedavisinde lenfoma kurulması tarif. Bu araba T hücreleri ile diğer transgenes test diğer ajanlar ile araba T hücrelerinin kombinasyonu etütler veya diğer evlat edinen hücre terapisi ya da immünoterapi stratejileri lenfoma karşı kullanımı için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>FC121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>FC122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml pestle and microtube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>431-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S hydrochloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FIL8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100759</td>
			<td>1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100552</td>
			<td>1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting beads &#8211; CountBright absolute counting beads</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239785-1GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-1440-03</td>
			<td>Sold by Sigma- Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer - LSR Fortessa x20</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>658222R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemacytometer</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>HC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H0887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>88-7121-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL2, Proleukin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>PL 00101/0936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vivo bioluminescence imaging system &#8211; in vivo xtreme II imaging system</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T149094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin Calcium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423114</td>
			<td>1 in 100 staining dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer - Lumistart Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Diaclone</td>
			<td>861.050.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL-Eco</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP229540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum E cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td>(RRID:CVCL_B488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553294</td>
			<td>Clone &#160;37.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3&#949;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553057</td>
			<td>Clone &#160;145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>577806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>004-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T3924&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a syngeneic mouse b-cell lymphoma model for pre-clinical evaluation of cd19 car t cells

CD19 chimeric antijen reseptör (araba) T-hücre tedavisi şaşırtıcı klinik başarı iki ikinci nesil chimeric antijen reseptör (CARs) onayı ile akut lenfoblastik lösemi (ALL) andnon-Hodgkin Lenfoma (NHL) açmıştır. Alanın odak şimdi nerede daha az etkileyici tam yanıt oranları gözlenmektedir diğer hematolojik maligniteler bu başarılar taklit olduğunu. Daha fazla araba T hücreleri veya diğer tedavi şekilleri, iş yönetimi mühendislik başarıyla diğer kanser ayarları başarılı tedavi için engelleri aşmak.
Bu yüzden hangi-ebilmek davranış diğerleri CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik test modeli mevcut. Bu iyi test B hücreli lenfoma model sonuçlarında bilgilendirici araba T-hücre tedavisi genel olarak etkilenebilir.
Bu iletişim kuralı kalsiyum fosfat transfection Plat-E yapımcı hücre MP71 retroviral yapıları ve pCL-Eco ambalaj plazmid salgılanan retroviral parçacıklar topluluğu tarafından takip ile araba T hücreleri fare tekrarlanabilir üretimi sağlar ve Rekombinant insan fibronektin parçası ve Santrifüjü kullanarak hedefidirler. Retroviral hedefidirler geçerliliğini ve hedef lenfoma hücreleri ex vivo, akış sitometresi, luminometry ve enzim bağlı immunosorbent kullanılarak öldürmek için yetenek araba T hücrelerinin onay assay (ELISA), ayrıca tanımlanmaktadır.
Araba T testleri için protokolleri hücreleri vivo içinde lymphoreplete ve lymphodepleted syngeneic fareler, kurulan, sistemik lenfoma taşıyan açıklanmıştır. Anti-kanser faaliyet içinde vivo bioluminescence ve hastalık ilerleme tarafından izlenir. Biz tipik sonuçları giderme kurulan B hücreli lenfoma 1st veya 2nd üretimi arabalar lymphodepleting öncesi klima ve araba T kullanan zaman uzun süreli remisyon elde fareler bir azınlık ile birlikte kullanan göstermek IL-12 lymphoreplete farelerde ifade hücreleri.
Bu protokoller CD19 araba T hücreleri farklı ek değişiklik, araba T hücrelerinin kombinasyonları ve diğer terapötik ajanlar ile değerlendirmek için kullanılan ya da farklı hedef antijenlere karşı araba T hücreleri kullanımı için uyarlanmış.

İçin yüksek verimlilik iletim T hücrelerinin taze retroviral parçacıklar elde etmek gereklidir. PCL-Eco yapımcı plazmid ve pMP71 retrovirüsü plazmid Plat-E hücre satırıyla transfection retroviral parçacıklar salgı süpernatant hücresine artış sağlar. MCherry gibi bir floresan marker gen retrovirüsü kodlandığında, başarılı transfection floresans mikroskobu (Şekil 1) tarafından onaylanabilir. Virüs içeren süpernatant transfected Plat-E hücrelerden T hücreleri ile 2 spin-fection fibronektin parçası kaplı tabaklarda yuvarlar transduce için kullanılır. İletim verimliliği iletim yolu ile akış sitometresi 4 gün sonrası belirlenebilir. Başarılı bir şekilde transduced hücreleri retrovirüsü (Şekil 2) kodlanmış marker gen ifade. İletim verimliliği aralığı ~ % 50-90 verimlilik ilk nesil reseptörleri ile ~ 10-%40 araba ile yakın retroviral paketleme kapasitesi oluşturur. Marker gen ekspresyonu başarılı retroviral iletim gösterirken, hücrelerle o hızlı hedef antijen onların yüzey üzerinde ilgi çekici üzerine araba T hücrelerinin işlevselliği göstermek için her şeyden önemlidir. Hedef hücre hatları için hızlı luciferase modifiye luciferase deneyleri içinde hücre-kill araba T hücreleri doğrudan (Şekil 3A) tarafından derecesini test etmek için kullanılabilir. Ortak kültür üzerine araba T hücreleri tarafından ELISA, belirlenen hedef hücrelerle efektör sitokinler sürümünden de araba T hücre sitotoksisite (Şekil 3B ve 3 C) dolaylı bir ölçüt olarak kullanılabilir.
Bu protokol için üretilen araba T hücreleri lymphoreplete farelerde siklofosfamid (intravenöz enjekte), 5 x 105 A20 hücre (Şekil 4) IV enjeksiyonu öncesinde 1 gün 100 mg/kg doz sistemik A20 lenfoma kurarak değerlendirilebilir. IP enjeksiyon vivo içinde bioluminescence Imager kullanarak biyoluminesans ve görüntü yakalama ile tümör yükü (Şekil 5A-C) boyunca sabit bir yatırım getirisi ve pozlama zaman kullanarak izlemek için kullanılabilir. Hızlı IL-12 modifiye araba T hücreleri hastalıksız sağkalım fareler (Şekil 5 d) yaklaşık % 25 veren önceden Merkezi Klima lymphodepleting ile sistemik lenfoma ortadan kaldırılması yeteneğine sahiptirler. Lymphodepleting, Önkoşullanma 5 tarafından elde Gy TBY 1 gün önceden IV yönetim araba T hücrelerinin önemli ölçüde artırır engraftment (Şekil 6). Bu modelde, ilk nesil araba T hücreleri genellikle hastalıksız sağkalım % 100 fare (Şekil 7) inducing sistemik A20 lenfoma ortadan kaldırılması yeteneğine sahiptirler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig1.jpg"> Şekil 1. Plat E hücre başarılı transfection onayı. Plat-E hücreleri retroviral araba inşa etmek ve pMP71 ve pcl-Eco ambalaj vektör plazmid DNA ile transfected. Başarılı transfection mCherry floresan marker gen ifade tarafından gösterilir. A) parlak alan mikroskobu, B) floresan mikroskopi ve C) birleştirilmiş resimler gösterilir. Büyütme = 50 X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig2.jpg"> Şekil 2. İletim verimliliği akış sitometresi tarafından belirlenmesi. Akış Sitometresi gün 4 mesaj iletim, zombi UV canlı/ölü, mCherry, BV711 kullanarak fare T hücreleri iletim verimliliğini belirlemek için kullanılır ve BV785 canlı tespiti için aracı, CD4 ve CD8 hücreleri, sırasıyla oluşturur. Temsilcisi sonuçlarını A) Non-transduced, B) mCherry.αmCD19.mCD3z ve C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 1 / geçişi ile gösterilir) tekli 2) canlı hücreleri 3) CD4 ve CD8 4) ve 5) mCherry pozitif hücrelerinin araba ifade değerlendirilmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig3.jpg"> Şekil 3. Doğrulama araba T-hücre faaliyetinin. ΑmCD19 araba T hücreleri ortak kültürlü A20 lenfoma hücrelerini hızlı luciferase için modifiye (1 x 104: 1 x 104) bir U-alt 96-şey plaka 16 h için. Ortak kültür sonra hücreleri pelleted, ve süpernatant denizden çıkarıldı. A) hücreleri PBS içinde yeniden askıya alınmış ve luminometry hedef hücre canlılığı değerlendirmek için kullanıldı. Ortak kültür süpernatant IL-12 (C) ve IFNγ (B) varlığı için değerlendirildi. Ortak kültür süresinin uzunluğu ve araba T hücre hedef hücrelere oranı gerekir, optimize edilebilir her araç için inşa ve hedef hücre satırı. PMA ve ionomycin tedavi olumlu bir denetim olarak yanıt vermek için onların yetenek hücreleri ve T hücreleri kalitesini doğrulamak için kullanılabilir. Hata çubukları SD istatistiksel analiz tek yönlü ANOVA kullanarak gerçekleştirilen gösterir. p < 0.001). Bu rakam17değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig4.jpg"> Şekil 4. A20 lenfoma lymphodepletion olmadan kuran. Siklofosfamid lymphodepletion neden olmadan lenfoma indüksiyon verimliliğini artırabilirsiniz. A) 6-8-hafta-yaşlı BALB/c fare siklofosfamid 100 mg/kg IV teslim sonra kan sayımı. Hata çubuklarını göster SD B) 6-8-hafta-yaşlı BALB/c fare sonra 100 mg/kg siklofosfamid veya serum gün -1 IV teslimi ve IV teslim gün bir luminometer kullanarak ölçülen 0 5 x 105 A20 hücre Lenfomasi yükünü. C) farelerde yaşama B). Hata çubukları SD istatistiksel analiz 2 yönlü ANOVA kullanarak gerçekleştirilen gösterir. ** p < 0,01, *** p < 0.001). Bu rakam Kueberuwa ve ark. değiştirildi 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig5.jpg"> Şekil 5. Lenfoma yük ve hayatta kalma izleme. Luciferase ifade A20 lenfoma taşıyan fareler 100 µL mayi (IP) enjeksiyonu 30 mg/mL biyoluminesans almak ve görüntüleme sistemi bir vivo içinde bioluminescence kullanarak görüntüsü. A) fareler ventral tarafta 1 dk. için maruz kalan ve hemen görüntüye tümör kitleleri organları (B)her iki tarafında almak için dorsal devrildiğinde. C) değişen αmCD19 araba T hücreleri lymphodepletion olmadan alma BALB/c fare lenfoma yükünün temsilcisi sonuçları. Hata çubuklarını göster SEM D) aynı farelerin sağkalım oranı. Bu rakam Kueberuwa ve ark. değiştirildi 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig6.jpg"> Şekil 6. Lymphodepletion etkileri. A) 5 Gy TBY 0,02 Gy/dak; doz oranında aldıktan sonra 6-8-hafta-yaşlı BALB/c farelerin kan sayımı hata çubukları iki yönlü ANOVA göre SD istatistiksel analiz gösterir. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. B) izleme, CD4+ ve CD8+ araba T mCherry marker gen 7 gün sonrası yönetim için akış sitometresi tarafından fareler periferik kan hücreleri. SD hata çubuklarını göster Bu rakam Kueberuwa ve ark. değiştirildi 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig7.jpg"> Şekil 7. Araba T hücre lymphodepleting öncesi Klima aktivitesiyle. Gün önce araba T hücreli yönetim 5 Gy TBY etkisini gösteren tipik sonuçları. A) 100 µL mayi (IP) enjeksiyonu görüntüleme sistemi bir vivo içinde bioluminescence kullanarak 30 mg/mL biyoluminesans sonra farelerin görüntüleme görüntüleme ve (B) grafik görüntüler. Hata çubuklarını göster SEM C) aynı farelerin yaşam. Bu rakam değiştirilmiş fromKueberuwa vd oldu 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells at JoVE.com

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngeneic fare B hücreli lenfoma manken CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik değerlendirme için

Burada, üretim ve retroviral iletim ve kullanımı karşı kurulan syngeneic A20 B hücreli lenfoma veya lymphodepleting olmadan BALB/c farelerde tedavi olarak fare CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik test için bir iletişim kuralı mevcut önceden Klima.

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Bu yöntem bize CAR T-hücre immün terapi alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, CAR T-hücrelerinin genetik modifikasyonu ve diğer bağışıklık tedavileri ile kombinasyon gibi. Bu tekniğin ana avantajı Lenfo dolu ve Lenfo tükenmiş ayarları arasında karşılaştırmalar sağlar. Bu bize hem hastalığın ilerlemesi ve terapötik CAR T-hücreleri ile etkileşiminde endojen bağışıklık hücrelerinin rolünü görmek için izin verir.Bu modelde öğrenilen dersler doğrudan CEA gibi diğer hedefleri ile şeker evine tercüme edilebilir, çünkü katı tümör tanısı nda tedavi için 10 olarak bu tekniğin etkisi. Bu yordamı başlatmak için. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli tüm ortam ve hücreleri hazırlayın. İlk gün tam DMEM'de 15 santimetre kare lik kültür yemekleri. Tohum 7.5 milyon platin E-Cells bu yemeklerde ve kuluçka gecede 37

a-syngeneic-mouse-b-cell-lymphoma-model-for-pre-clinical-evaluation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

14.3K Görüntüleme.  University of Manchester. Bu yöntem bize CAR T-hücre immün terapi alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, CAR T-hücrelerinin genetik modifikasyonu ve diğer bağışıklık tedavileri ile kombinasyon gibi. Bu tekniğin ana avantajı Lenfo dolu ve Lenfo tükenmiş ayarları arasında karşılaştırmalar sağlar. Bu bize hem hastalığın ilerlemesi ve terapötik CAR T-hücreleri ile etkileşiminde endojen bağışıklık hücrelerinin rolünü görmek için izin verir.Bu modelde öğrenilen dersler d...