Bu yöntem 3D yapı tümör hücrelerine karşı immün hücre sitotoksisite değerlendirilmesi hakkında immünoterapi alanında anahtar soruya cevap yardımcı olabilir. Bu yöntemin başlıca avantajları, basit olması ve ileri görüntüleme teknolojisi ve hassas bir immünolojik tsede biraraya vardır. PBS beş mililitre ile ilgi kolorektal kanser hücre hattı yıkama ve 37 santigrat derecede beş dakika için 0.5 mililitre tripsin ile şişe alt hücreleri kaldırarak başlayın.
Bir mikroskop altında müfreze doğruladıktan sonra, tam orta 10 mililitre ile hücre dissosyasyon enzimi nötralize ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Sayma için beş mililitre taze tam ortamda pelet resuspend ve mililitre konsantrasyonu başına üçüncü hücrelere 1,5 kez 10 hücreleri yeniden askıya. Daha sonra 96-iyi yuvarlak alt plaka her kuyuiçine hücrelerin 200 mikrolitre tohum ve 5% CO2 ve% 95 nem ile 37 derece Santigrat kuvöz içinde otomatik bir görüntüleme cihazı içinde plaka yerleştirin.
Aygıtın satın alma yazılımına giriş yapın ve Satın Almak için Zamanlama'yı seçin, Gemi Ekle, Programda Taraya ve Yeni Gemi Oluştur'u başlatın. Ardından, scan türü Spheroid'i seçin ve uygun parlak alan ve floresan kanallarını seçin. Büyütmeyi 10 kata ayarlayın ve plaka modelini ve görüntüleme cihazı çekmecesindeki konumunu seçin.
Görüntülenecek kuyuların konumunu seçin ve hücre adı, hücre türü ve hücre sayısını içeren deneyin açıklamasını girin. Analiz kurulumu için, Daha Sonrasına Kadar Analiz'i ertele'yi seçin, zaman çizelgesine sağ tıklayın ve Seçili Tarama Grubu Aralığını Ayarla'yı seçin ve Her dört saat ve Toplam 24 saat için Tarama Ekle'yi ayarlayın. Daha sonra otomatik görüntüleme cihazında kuluçkadan sonra başlangıç saatini en az bir saat olarak ayarlayın.
Küresel büyüme ilerlemesini kontrol etmek için, her iki günde bir görüntüleme yazılımına giriş yapın ve Son Taramaları Görüntüle'yi seçin. İlgi alanı deneyine çift tıklayın ve Görüntü Kanalları panelinde Brightfield'ı seçin. Daha sonra, herhangi bir orta buharlaşma efektini sınırlamak için dört gün boyunca her kuyuda 50 mikrolitre tam ortam ekleyerek küresel lerin çapını ölçmek için Ölçü Görüntü Özellikleri aracını kullanın.
Küresel ler uygun deneysel boyuta ulaştıklarında, plakayı dikkatlice açılayın ve her kuyudan 150 mikrolitrelik tam ortamı, küresel leri rahatsız etmeden nazikçe çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra, atılan orta yı Annexin V Red'in 1 ila 200 çözeltisinin 50 mikrolitresiyle değiştirin ve plakayı 15 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Santrifüj 15 mililitrelik konik tüp içinde CAR CD19 T hücreleri transduced ve tam orta iki mililitre pelet resuspend.
Saydıktan sonra, tam orta konsantrasyon mililitre başına beşinci hücrelere iki kez 10 hücreleri seyreltin. Daha sonra her küresel içeren kuyuya 100 mikrolitre CAR CD19 T hücresi ekleyin ve plakayı otomatik görüntüleme cihazına geri döndürün. Satınalma yazılımında, Kazanılması Gereken Zamanla'yı seçin ve tarama zaman çizelgesine sağ tıklayın.
Zaman Çizelgesidüzenle'yi seçin ve silmek için silmek için scan grubuna sağ tıklayın. Zaman çizelgesine tekrar sağ tıklayın ve Seçili Tarama Grubu Aralığını Ayarla'yı seçin ve Her 1,5 saat ve Toplam 24 saat için Tarama Ekle'yi ayarlayın. Ardından, otomatik görüntüleme aygıtında kuluçka ya da program taramalarını kaydet seçeneğini belirleyin.
Otomatik görüntü analizi için tarama yazılımında Son Taramaları Görüntüle ve Başlatma Analizi'ni seçin. Yeni Analiz Tanımı oluştur ve analiz türü Spheroid'i seçin ve görüntü kanallarını analiz edilecek şekilde ayarlayın. En az 10 temsili resim seçin ve tüm görüntü yığınındaki varsayılan analiz yordamını önizleyin.
Parlak alan maskesi parametrelerini değiştirin ve seçilen parametrelerin küresel leri doğru şekilde algıladığını onaylayarak görüntü yığınını önizleyin. Seçili parametrelerin küresel leri doğru bir şekilde algıladığını doğrulamak için yeşil maske parametrelerini değiştirin ve görüntü yığınını önizleyin. Seçilen parametrelerin küresel leri doğru şekilde algıladığını doğrulamak için kırmızı maske parametrelerini değiştirin ve görüntü yığınını önizleyin.
Her zaman noktasında her olayı yakalamak için izin verecek parametreleri bulmak mümkün olmayacaktır akılda tutarak, gürültü ve duyarlılık üzerinde en iyi sinyali elde etmek için dikkat edin. Sonra analizörü başlatın. Çözümleme tamamlandığında, ilgi ölçüsünü ayıklayın ve analiz edilen dosyayı ve grafik ölçümleri seçeneğini seçin.
İlgi ölçümlerini, tarama ve kuyuyu seçin. Seçili ölçümleri çeşitli dosya biçimlerinde ayıklamak için Verileri Dışa Aktar'ı tıklatın. Ardından, görüntüleri ayıklamak için çözümlenen dosyayı seçin ve Görüntüleri ve Filmleri Dışa Aktar'ı seçin.
Transektasyont t hücreleri cd19 CAR ekspresyonu ve transduced kolorektal kanser hücrelerinde CD19 ekspresyonu akış sitometrisi ile doğrulanabilir. Burada, tipik bir küresel deneyin sonucu gözlemlenebilir. Sahte T hücrelerinin aksine, CD19 CAR T hücreleri özellikle kolorektal kanser hücre hattı kaynaklı sferoidler öldürmek edebiliyoruz, büyük ölçüde canlı tümör hücrelerinin sayısını azaltarak.
Zaman içinde küresel sınırlar içinde toplam yeşil ve kırmızı sinyallerin evriminin izlenmesi, CD19 CAR T hücre enjeksiyonundan kısa bir süre sonra, apoptoz sinyali hızla arttıkça küreseloidlerin boyutunun hızla küçüldüğünü ortaya koymaktadır. Bu prosedürü takiben, ilaç taraması, T hücre hareketliliği veya küresel formasyon ile ilgili ek soruları yanıtlamak için toksisite tahlilleri, hücre göçü tahlilleri veya küresel yapı ölçümleri gibi diğer yöntemler de yapılabilir.
