Burada, bir referans proteine göre sinaptik protein dağılımını belirlemek için immünoresans, konfokal mikroskopi ve bilgisayar tabanlı analiz uygulayan bir protokol uyguluyoruz. Yöntemimiz mutlak floresan düzeyleri yerine bir oran kullanarak immünfloresans boyama doğal değişkenlik atlatır. Ayrıca bu yöntem le farklı düzeylerde protein dağılımının heterojenliğini analiz edebilirsiniz.
Tüm beyin dilimlerinden beyin bölgelerine, hipokampusun farklı katmanları gibi alt bölgelere kadar. Bu teknik, fareler dışındaki beyin ve model sistemleri dışındaki farklı dokularda protein dağılımını belirlemek için uyarlanabilir. El yazmasında açıklandığı gibi daha önce izole edilmiş ve sabit fare beynini yıkayarak başlayın.
Sonra% 30 sakaroz 0.1 molar PB ile 15 mililitre reaksiyon tüpü için beyin aktarın. Kriyo, beyni 48 saat boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırmak için ya da batana kadar. Bundan sonra ilgi alanına bağlı olarak kriyo korumalı beyin kırpmak için keskin bir bıçak kullanın. Sonra bir kriyo kalıp beyin yerleştirin ve kabarcıklar önlemek için emin ve böylece kesme bir koronal düzlemiçin beyin yönlendirmek emin gömmek için Optimal Kesme Sıcaklık Bileşik ekleyin.
Dondurucu kalıbı eksi 80 derece lik dondurucuya, dondurulana kadar yerleştirin. Dondurulmuş dokuyu kriyo mikrotomu üzerine monte edin ve mikrotom sıcaklığına göre dengelemek için bölümden en az 15 dakika önce bekleyin. Beyni 25 mikrometre kalınlığında koronal dilimlere ayırmaya başla.
Beyin dokusudokunmadan dikkatle ilk dilimIN OCT için bir cam kanca kullanın. OCT cam kanca yada yapışacak. İlk kuyuiçine beyin dilimi aktarmak için cam kanca kullanın.
0,1 azı pb ile dolu bir 24 kuyu plaka iyi başına üç bitişik dilim toplamak. Dilimleri iki haftaya kadar boyanana kadar dört derecede saklayın. Bağışıklık boyama için dilimleri hazırlamak için beyin dilimleri çizim olmadan bir kuyudan PB çözeltisi kaldırmak için plastik bir pipet kullanın. Sonra aşırı OCT onları yıkamak için taze PB 250 mikrolitre eklemek için 1000 mikro litre pipet kullanın.
Dilimlerin kurumasını önlemek için her kuyu için bu yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, pb çözeltisini ilk kuyudan çıkarmak için plastik bir pipet kullanın. Iyi tekrar iyi çalışan başına engelleme tampon 250 mikrolitre eklemek için 1000 mikrolitrelik pipet kullanın.
Tabağı oda sıcaklığında üç saat boyunca çalkalayıcıyla kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında bir reaksiyon tüpü ne kadar iyi başına 250 mikrolitre antikor tamponu ekleyin. Daha sonra doğrudan çözelti içine antikor boru uygun miktarda eklemek için 2 mikrolitre pipet kullanın ve yavaşça karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet.
Sonra uygun karıştırma emin değil bu seyreltilmiş antikor girdap. Iyi plastik bir pipet ile engelleme tampon kaldırmak ve iyi başına birincil antikor çözeltisi 250 mikrolitre ekleyerek iyi çalışma. Tabağı bir gecede dört derece lik bir çalkalayıcıya kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün plastik bir pipet ile antikor çözeltisi kaldırın. 300 mikrolitre yıkama tamponu ile dilimleri yıkayın her üç kez on dakika oda sıcaklığında bir shaker üzerinde yıkayın. Yıkama sırasında, karanlıkta çalışan, daha önce birincil antikor ile yapılan aynı şekilde bir reaksiyon tüpü bir çift ikinci antikor için flor seyreltmek.
Yıkama tamamlandıktan sonra plastik bir pipet ile yıkama tamponu çıkarın ve kuyu başına ikincil antikor çözeltisi 250 mikrolitre ekleyin. 90 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Kuluçka tamamlandıktan sonra plastik bir pipet ile antikor çözeltisi çıkarın.
Bölümleri üç kez yıkama tamponu ile aynı şekilde aynı şekilde tampon bir yıkayın. Bu yıkama sırasında 0.1 molar PB DAPI leke seyreltilmiş bir ila 2000 konsantrasyon elde etmek. Plakadan yıkama tamponu çıkardıktan sonra 250 mikrolitre DAPI çözeltisi ekleyin ve 5 dakika boyunca çalkalayıcının oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Plastik bir pipet ile DAPI çözeltisi çıkardıktan sonra iyi başına 0,1 molar PB 500 mikrolitre eklemek için 1000 mikrolitre pipet kullanın. Bir stereoskop altında bir mikroskop slayt yerleştirin. Slayta 0,1 molar PB'den üç ayrı damla eklemek için ince bir fırça kullanın.
Fırçayı kullanarak slaytta damla başına bir dilim yerleştirin ve ardından dilimleri düzleştirmek ve yönlendirmek. Tüm dilimler doğru konumlandırıldıktan sonra aşırı PB kaldırmak için bir kağıt mendil kullanın ve dilimleri tamamen kurutmadan dikkatlice kurulayın. Daha sonra slayt üzerine 80 mikrolitre gömme ortamı ekleyin ve dikkatlice beyin dilimleri gömmek için bir kapak kayma ile kaplayın.
Işık maruziyetini önlemek için slaytları kapatın ve duman kaputunda 1-2 saat kurumaya bırakın ve sonra konfokal mikroskop mikroskobu için hazır olana kadar dört derece santigrat derecede bir mikroskop slayt kutusunda saklayın. El yazmasında açıklandığı gibi farklı kanallar için tüm beyin diliminin sanal dokularını aldıktan sonra dosyayı tıklayarak tüm tek kanalları veya bir görüntüyü FIJI'ye yükleyin ve açın. Sonra DAPI kanalında bir yarımküreyi çizgilemek için ücretsiz el seçim aracını kullanın.
Edet'i tıklatın, sonra seçim yapın, ardından seçili bölgenin maskesini oluşturmak için maske oluşturun. Sonra analiz tıklayın ve sonra tek kanallar için ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek için parçacıkları ölçmek. Her kanal için ortalama floresan yoğunluk değerlerini belirlemek için tek kanal seçtiğinizden emin olun.
Bundan sonra, tek kanallar için ortalama floresan yoğunluğunu elektronik tabloya kopyalayın. İlgi alanı ndaki tek kanallar için ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek için alanı serbest el seçim aracı ile belirleyin. DaPI ile boyandıktan sonra çekirdek beyin kesitleri bir delinme deseni vardır ve yüksek hücre yoğunluğu olan bölgeler hücre yoğunluğu düşük olan bölgelere göre daha parlaktır.
Mover antikor ile boyama synaptophysin daha homojen dağılımı ortaya ise beyin boyunca parlak sıcak nokta alanları ve dimmer alanları ile heterojen dağılımı ortaya koymuştur. Görüntülerin bir bindirme Sinaptophysin gösteren yeşil floresan karşılaştırıldığında Mover protein gösteren kırmızı floresan diferansiyel dağılımı gösterdi. Sayısallaştırma analizinden sonra hem hem ferisit hem de sinaptophysin için farklı kanallar ve ilgi alanları için floresan yoğunluk değerleri belirlenmiştir.
Mover floresan değerlerinin Synaptophysin floresan değerlerine oranı, Sinaptik veziküllere göre yüksek ve düşük Mover düzeylerine sahip mover düzeyleriile Mover'ın heterojen dağılımını göstermektedir. Göreceli Mover bolluk ilgi bir alanda oranı yarımkürede göre ve bir yüzdesi tercüme ne kadar Mover ortalamaya göre ilgi bir alanda mevcut olduğunu gösterdi. Hipokampusun alt alanlarında farklı tabakalar için göreceli Mover bolluğu belirlenmiştir.
İlgilenen üç bölge, ilgili katmanlarda ilgili yarımkürenin oranıile karşılaştırılarak ölçülür. Bu işlem kolayca adapte edilebilir ve süper çözünürlüklü mikroskopi gibi farklı görüntüleme teknikleri ile kombine ek olarak ilgi proteinin in alt hücresel dağılımını belirlemek için. Bu teknik aynı zamanda genetik olarak modifiye edilmiş veya ilaç la tedavi edilmiş hayvanlar gibi farklı model sistemlerine de uygulanabilir.
Bu farklı deneysel koşullar ve hatta türler arasında karşılaştırmalı bir yaklaşım için izin verebilir.
