Bu yöntem kloroplast alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, örneğin, kloroplast protein ithalat makine bileşimi. Bu yeşilleme ve fotosentez ve dolayısıyla gezegende gıda üretimi için gereklidir. Moleküler makine, TOC ve TIC adı verilen kloroplastın dış ve iç yapısında iki ayrı kompleksten oluşur, ancak bileşimi tam olarak bilinmemektedir.
Bu tekniğin en büyük avantajı Arabidopsis TOC/TIC kompleksinin arınma yöntemi olan TAP-TOC arınması ile gerçekleştirilmesidir. Bu özel ve verimli bir yöntemdir. Kloroplast membran fraksiyonlarının, deterjan, çözünürlüğü veya afinite arınma izolasyonuna aşina olmadıkları için genellikle, bu yönteme yeni araştırmacılar mücadele edebilirler.
Arabidopsis bitkileri hazırlandıktan sonra, soğuk bir harç ve kum ile havaneli kullanarak, sıvı azot üç haftalık fideler 10 gram öğütün. Zemin dokulara soğuk taşlama tampon 20 mililitre ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve karışımın buzda çözülmesine izin verin.
Daha sonra, taşlama tamponu ile hızlı filtrasyon malzemesi iki kat ıslatın. 50 mililitrelik konik santrifüj tüpü içine filtrasyon malzeme iki tabaka ile homogenate filtre. 1, 500 kez g dört santigrat derece 10 dakika ve taze, önceden soğutulmuş 50 mililitre konik santrifüj tüp supernatant aktarın filtrasyon.
Santrifüjün aynı koşullarda bir kez daha tekrarlayın. Supernatant soğuk bir 38,50 mililitre ultracentrifuge tüp aktarın ve soğuk taşlama tampon ile 35 mililitreye kadar üst. Bir saat boyunca 100, 000 kez g ve dört santigrat derece numune santrifüj için ultracentrifuge kullanın.
Bir cam Teflon homogenizer kullanarak, taşlama tampon yeşil pelet resuspend. 100, 000 kez g ve bir saat için dört derece santigrat centrifuge ve supernatant atın. Bir x taşlama tampon 18,75 mililitre yeşil pelet resuspend için cam Teflon homogenizer kullanın.
Sonra başka bir 9.375 mililitre bir x taşlama tampon ekleyin. Son hacmi 37,5 mililitreye çıkarmak için 4 x solubilizasyon çözeltisinin 9,375 mililitresini ekleyin ve 30 dakika boyunca dört derece santigrat derecede dönen bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, bir saat boyunca 100, 000 kez g ve dört santigrat derece numune santrifüj için bir ultracentrifuge kullanın.
Çözünür membranları içeren süpernatantı 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. IGG agarose reçinesini hazırladıktan sonra, daha önce yıkanmış IGG agarose reçinesini 37,5 mililitre çözünür membran içeren 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Dört santigrat derecede dönen bir çalkalayıcıyla gece boyunca kuluçkaya yat.
Ertesi gün, tortu IGG agarose rezorin 100 kez g ve dört derece santigrat beş dakika. Supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. IGG agarose regin tampon A 37.5 mililitre ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dönen bir shaker inkübat oldu.
Metin protokolünde belirtildiği gibi rekaryonu tortulama ve yıkamaya devam edin. Bundan sonra, IGG agarose reçinesini 35 mikron filtreli 500 mikrolitrelik bir spin sütununa aktarın. Denge için 300 mikrolitre TEV elüsyon tamponu ile boncukları iki kez yıkayın.
Daha sonra, TEV elüsyon tampon 300 mikrolitre eklemek TEV proteaz 10 mikrolitre içerir. Spin sütununa termmikterle 16 derece santigrat ve 350 rpm'de boncuklarla iki saat kuluçkaya yatırın. Sonra, spin sütunu açın ve yeni, temiz, 1,5 mililitrelik bir tüp yerleştirin.
Bu tüpü 100 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün. Bu çalışmada transgenik A.thaliana bitkilerinden TAP etiketli kloroplast zarf protein kompleksi saflaştırılır. İmmünoblot analizi TAP-TOC159'un TOC kompleksinin TOC75 ve TOC33 ile etkileşime girdiğini doğrulamaktadır.
TOC159 fosforilasyon bilinen kloroplast dış membran kilaz, KOC1 de izole edilmiştir. TIC110'un varlığı, izole TAP-TOC159 kompleksinin tic kompleksinin bileşenlerini de içerdiğini ortaya koymaktadır. FBN1A antikorları TAP-TOC159 kompleksini tanıyamadı ve kontaminasyonun olmadığını gösteriyordu.
Negatif kontrolde, immünopsipitated NTAP proteini TOC, TIC proteinlerinin hiçbiriyle birlikte izole edilmedi ve TAP-TOC159 saflaştırmasının özgüllüğünü doğruladı. Bu yöntem kloroplast protein ithalatı içine fikir sağlayabilir rağmen, potansiyel Arabidopsis thaliana şişe sisteminde başka bir kompleks uygulanabilir. Bu prosedürü takiben, bilinen bileşenlerin varlığını göstermek veya TOC ve TIC komplekslerinin yeni bileşenlerini belirlemek için batı lekeleme veya kütle spektrometresi gibi başka yöntemler de uygulanabilir.
Bu teknik, TOC ve TIC komplekslerinin yeni bileşenlerinin işlevini araştırmak için kloroplast protein ithalat alanında araştırma nın önünü açmıştır.
