Cette méthode peut aider à relever les principaux défis dans le domaine de l’immunothérapie du cancer en facilitant le développement de vecteurs oncolytiques pour une immunomodulation ciblée. Le principal avantage du système génétique inverse appliqué est sa polyvalence; par conséquent, les vecteurs peuvent être adaptés pour répondre à diverses questions de recherche et cibler les tumeurs avec diverses signatures immunitaires. Les étapes de propagation du virus, en particulier la détermination du point de temps optimal pour la récolte du virus sont difficiles à apprendre d’un protocole texte, car la formation de syncytie doit être évaluée visuellement au fil du temps.
Pour commencer la conception et cloner des vecteurs immunomodulateurs recombinants tels que décrits dans le manuscrit. Ce protocole décrit des étapes spécifiques pour la mise au point d’un vecteur oncolytique du vaccin antirougeoleux, codant une cellule T bispécifique engagée. Pour sauver le virus de la rougeole de l’ADNC, 24 heures avant la plaque de transfection, les cellules productrices du virus de la rougeole se sont uniformément accumulées sur une plaque murale de 6.
Graine 200 000 cellules en 2 millilitres DMEM contenant 10 pour cent de FBS par puits pour atteindre 65 à 75 pour cent de confluence au moment de la transfection. Mélanger 5 microgrammes d’ADN recombinant codant l’antigène du virus de la rougeole qui sera utilisé pour transfecter les cellules. Plasmides appropriés et un journaliste fluorescent dans un volume total de 200 microlitres de DMEM.
Ajouter 18,6 microlitres de réhésif transfection liposomique au mélange et feuilleter immédiatement le tube pour mélanger. Incuber ce mélange de transfection pendant 25 minutes à température ambiante. Pour transfecter les cellules productrices de MV enlever le milieu de la plaque de puits 6 cultivés à 65 à 75 pour cent de confluence et ajouter 1,8 millilitres de DMEM avec 2 pour cent de FBS et 50 microgrammes par millilitre kanamycine par puits.
Ajouter ensuite le mélange de transfection dropwise à chaque puits et tourbillonner soigneusement. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu par 2 millilitres de DMEM frais par 2 % de FBS et 50 microgrammes par millilitre de kanamycine et répétez-le lorsque le milieu devient acide reconnu par la couleur jaune.
Utilisez un microscope pour observer les cellules quotidiennement pour l’expression des gènes des journalistes et la formation de syncytia. Lorsque de grandes syncytia composées de 20 cellules ou plus sont visibles ou lorsque les cellules deviennent trop denses, le virus. 24 heures avant la récolte prévue semences environ 1,5 millions de cellules productrices de MV dans 12 millilitres de DMEM avec 10 pour cent FBS sur des plats de 10 centimètres pour atteindre 65 à 75 pour cent de confluence au moment de l’inoculation du virus.
Pour recueillir le virus progyny utiliser un grattoir cellulaire pour gratter soigneusement les cellules productrices adhérentes de la plaque murale 6 avec des cellules transfectées. Transférer le milieu contenant les cellules grattées dans un tube de centrifugeuse. Centrifugeuse pendant au moins 2500 fois G et 4 degrés Celsius pendant 5 minutes pour enlever les débris cellulaires.
Après centrifugation mélanger le supernatant sans cellules avec le milieu sans sérum à un volume final de 4 millilitres pour préparer l’inoculum. Retirer le milieu du plat de 10 centimètres avec les cellules productrices de MV et ajouter l’inoculum aux cellules. Incuber pendant au moins 2 heures à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone.
Après incubation ajouter 6 millilitres de DMEM avec 10 pour cent FBS et incuber les cellules pendant la nuit. Remplacez ensuite le milieu par 12 millilitres de DMEM frais par 10 pour cent de FBS et couvez à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone jusqu’à la récolte. Observez les cellules au moins deux fois par jour.
Avant l’éclatement de la syncytie lorsque la perturbation de la membrane devient visible, récoltez le virus. Pour récolter le premier passage enlever le supernatant de la plaque et ajouter 600 microlitres de sérum moyen libre. Ensuite, utilisez un élévateur cellulaire pour gratter les cellules et transférer dans un tube propre.
Immédiatement après ce gel, la suspension du virus dans de l’azote liquide et conserver à 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures pour assurer un gel complet. Déterminer les titres des stocks de virus dans les octuplicates par aliquot à l’aide de 96 plaques murales. Tirez d’abord les cellules productrices des flacons de culture cellulaire T75 dans un tube conique de 50 millilitres.
Comptez les cellules et ajustez la suspension cellulaire à 150 000 cellules par millilitre dans le DMEM avec 10% de FBS. Ajouter 90 microlitres de DMEM avec 10 pour cent de FBS par puits d’une plaque murale de 96. Ajouter ensuite 10 microlitres d’un aliquot du stock de virus aux 8 puits de la première colonne de la plaque.
Bien mélanger en faisant monter et descendre au moins 10 fois. Utilisez une pipette multicanal pour transférer 10 microlitres de chaque puits, de la première à la deuxième colonne, et bien mélanger en pipetting de haut en bas. Répétez cette demande pour chaque colonne afin d’obtenir des dilutions en série décuplées du virus à l’aide de pointes de pipette fraîches pour chaque étape de dilution.
Jetez 10 microlitres de chaque puits de la dernière colonne. Ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire avec 150 000 cellules par millilitre à chaque puits en vous assurant qu’il n’y a pas de touffes cellulaires. Incuber à 37 degrés Celsius, 5 pour cent de dioxyde de carbone pendant 48 heures.
Vérifiez la syncytie à l’aide d’un microscope léger. Comptez la syncytie dans chaque puits de la colonne avec le facteur de dilution le plus élevé contenant la syncytie visible. Pour les virus codant un journaliste fluorescent, la syncytie peut être comptée à l’aide de microscopie par fluorescence.
Pour l’analyse de la cinétique de réplication du virus de la rougeole un jour avant l’infection, 100 000 cellules vero dans 1 millilitre de DMEM avec 10% de FBS par puits sur 12 plaques murales avec au moins 2 puits pour chaque point d’intérêt. Pour infecter les cellules remplacer le milieu par 300 microlitres de milieu sans sérum contenant la quantité respective du virus. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone pendant au moins 2 heures.
Retirer l’inoculum et ajouter 1 millilitre de DMEM avec 10 pour cent de FBS et poursuivre l’incubation. Aux moments pertinents après la récolte de l’infection progynie virale en raclant directement les cellules dans le milieu. Transférer le contenu de chaque puits vers un tube individuel.
Casser le gel dans l’azote liquide et conserver à 80 degrés Celsius jusqu’à titration, puis procéder comme décrit dans le manuscrit. Pour commencer l’évaluation de la cytotoxicité médiée par cellules induites par le BTE par libération de LDH, d’abord isoler les produits transgènes sécrétés exprimés par les cellules cibles infectées par le virus et isoler les cellules effectrices immunitaires comme décrit dans le manuscrit. Ensuite, les cellules cibles des graines dans une plaque murale u-bottom 96 et comprennent des échantillons tels que décrits dans le manuscrit.
Ajouter des immunomodulateurs précédemment isolés aux concentrations désirées aux échantillons respectifs. Ajouter les cellules transfuges immunitaires aux rapports désirés et ajouter du milieu à un volume total de 100 microlitres par puits. Incuber pour les délais précédemment déterminés à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone.
45 minutes avant la collecte de l’échantillon ajouter 10 microlitres de 10X Lysis Solution aux puits contenant des échantillons de T max et les contrôles moyens correspondants et poursuivre l’incubation. Centrifuger les cellules à 250 fois G pendant 4 minutes. Transférer 50 microlitres de supernatant de chaque puits vers les puits d’une plaque murale à fond plat de 96 parois en s’assurant de ne pas transférer les cellules.
Après avoir préparé la solution de substrat selon le fabricant ajouter 50 microlitres à chaque puits. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que les échantillons de T max deviennent rouges profonds. Après l’incubation ajouter 50 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits.
Centrifugeuse pendant 1 minute à 4000 fois G, puis utiliser une aiguille creuse pour enlever les bulles d’air. Mesurer l’absorption optique à 490 nanomètres et calculer comme décrit dans le manuscrit. Après l’inoculation avec des virus oncolytiques non modifiés et BTE codant contre la rougeole, les courbes de croissance des vecteurs comparés sur les cellules vero semblent similaires.
Les courbes de viabilité cellulaire sur les cellules mc38 murine de carcinome côlorectal exprimant habilement l’antigène carcinoembryonic humain et les récepteurs de MV CD46 après inoculation montrent que l’activité lytique du virus transgène d’encodage traîne derrière dans la ligne de cellule de tumeur murine. La cytométrie de flux de l’antigène cible exprimant des cellules incubées avec des BTE à cinq dilutions différentes a montré la liaison de BTE par des cellules d’une manière dépendante de concentration. Dans l’immunoblot après retrait magnétique des cellules associées de BTE a prouvé que quand bte non-ciblage ont été utilisés il n’y avait aucune quantité détectable des cellules ;alors que lors du ciblage des échantillons de BTE ont été utilisés cellules liées étaient présents dans la fraction d’élitution.
BTE médiation antigène cible spécifique et la concentration dépendante cytotoxicité des cellules T murines est indiqué par l’essai représentatif de libération LDH et montre que dans le présent exemple 15 pour cent de tuer cellulaire spécifique a été atteint à une concentration relativement élevée de BTE de 1 microgramme par millilitre par rapport aux cellules de référence. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de surveiller régulièrement les cellules pour vérifier la progression de l’infection. N’oubliez pas que les souches recombinantes du vaccin contre la rougeole, bien qu’atténuées, peuvent être dangereuses, en particulier pour les personnes immunodéprimées.
Évitez l’exposition en suivant les procédures de biosécurité appropriées. Les personnes qui manipulent des virus devraient être vaccinées avant d’effectuer ces méthodes. Suite à cette procédure, l’expression virale d’autres transgènes peut être réalisée afin d’analyser les interactions des hôtes de virus et les effets thérapeutiques.
Le développement de ces techniques a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biothérapie pour explorer les effets des immunomodulateurs exprimés localement dans de nombreuses entités tumorales;In Vitro, In Vivo, et aussi dans les essais cliniques.
