Este método puede ayudar a abordar los desafíos clave en el campo de la inmunoterapia contra el cáncer facilitando el desarrollo de vectores oncolíticos para la inmunomodulación dirigida. La principal ventaja del sistema genético inverso aplicado es su versatilidad;por lo tanto, los vectores se pueden adaptar para abordar diversas preguntas de investigación y apuntar tumores con diversas firmas inmunitarias. Los pasos de propagación del virus, especialmente determinar el punto de tiempo óptimo para el virus de la cosecha son difíciles de aprender de un protocolo de texto porque la formación de sincronía debe evaluarse visualmente con el tiempo.
Para comenzar a diseñar y clonar vectores inmunomoduladores recombinantes como se describe en el manuscrito. Este protocolo describe pasos específicos para el desarrollo de un vector de vacuna contra el sarampión oncolítico, que codifica un captador biespecífico de células T. Para rescatar el virus del sarampión del ADNr, 24 horas antes de la transfección de las células productoras del virus del sarampión uniformemente en una placa de 6 paredes.
Siembra 200.000 células en 2 mililitros DMEM que contienen 10 por ciento de FBS por pozo para lograr 65 a 75 por ciento de confluencia en el momento de la transfección. Mezclar 5 microgramos de ADN recombinante que codifica el antígeno del virus del sarampión que se utilizará para transfecar las células. Plásmidos apropiados y un reportero fluorescente en un volumen total de 200 microlitros de DMEM.
Añadir 18,6 microlitros de reactivo de transfección liposomal a la mezcla e inmediatamente mover el tubo para mezclar. Incubar esta mezcla de transfección durante 25 minutos a temperatura ambiente. Para transfectar las células del productor de MV eliminar el medio de la placa de 6 pozos crecido a 65 a 75 por ciento de confluencia y añadir 1.8 mililitros de DMEM con 2 por ciento FBS y 50 microgramos por mililitro Kanamycin por pozo.
A continuación, agregue la mezcla de transfección dropwise a cada pozo y gire cuidadosamente. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5 por ciento de dióxido de carbono. Al día siguiente reemplace el medio con 2 mililitros de DMEM fresco con 2 por ciento de FBS y 50 microgramos por mililitro de kanamicina y repita esto cuando el medio se vuelva ácido reconocido por el color amarillo.
Utilice un microscopio para observar las células diariamente para la expresión génica del reportero y la formación de sinc syncytia. Cuando la sincría grande que consta de 20 o más células son visibles o cuando las células se vuelven demasiado densas cosechan el virus. 24 horas antes de la cosecha prevista aproximadamente 1,5 millones de células productoras de MV en 12 mililitros de DMEM con 10 por ciento de FBS en platos de 10 centímetros para lograr una confluencia de 65 a 75 por ciento en el momento de la inoculación del virus.
Para recoger la proginia del virus utilice un rascador celular para raspar cuidadosamente las células del productor adherente de la placa de pared 6 con células transfectadas. Transfiera el medio que contiene las células raspadas a un tubo centrífugo. Centrifugar durante al menos 2500 veces G y 4 grados Celsius durante 5 minutos para eliminar los desechos celulares.
Después de la centrifugación, mezcle el sobrenadante libre de células con un medio libre de suero a un volumen final de 4 mililitros para preparar el inóculo. Retire el medio del plato de 10 centímetros con células productoras de MV y agregue el inóculo a las células. Incubar durante al menos 2 horas a 37 grados centígrados y 5 por ciento de dióxido de carbono.
Después de la incubación añadir 6 mililitros de DMEM con 10 por ciento FBS e incubar células durante la noche. Luego reemplace el medio con 12 mililitros de DMEM fresco con 10 por ciento de FBS e incubar a 37 grados centígrados y 5 por ciento de dióxido de carbono hasta la cosecha. Observe las células al menos dos veces al día.
Antes de que la sincronía estalle cuando la interrupción de la membrana se hace visible cosecha el virus. Para cosechar el primer pasaje retire el sobrenadante de la placa y agregue 600 microlitros de medio libre de suero. Luego usa un elevador de células para raspar las células y transferirlas a un tubo limpio.
Inmediatamente después de eso, congele la suspensión del virus en nitrógeno líquido y guárdelo a 80 grados Centígrados durante al menos 24 horas para garantizar una congelación completa. Determinar los títulos de las existencias de virus en octuplicados por alícuota utilizando 96 placas de pared. Primero tire de las células productoras de los matraces de cultivo celular T75 en un tubo cónico de 50 mililitros.
Cuente las células y ajuste la suspensión celular a 150.000 células por mililitro en DMEM con 10 por ciento de FBS. Añadir 90 microlitros de DMEM con 10 por ciento de FBS por pozo de una placa de pared de 96. A continuación, agregue 10 microlitros de una alícuota del stock de virus a los 8 pozos en la primera columna de la placa.
Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Utilice una pipeta multicanal para transferir 10 microlitros de cada pozo, de la primera a la segunda columna, y mezcle bien en pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Repita esto para cada columna para obtener diluciones de diezplicciones en serie del virus utilizando puntas de pipeta frescas para cada paso de dilución.
Deseche 10 microlitros de cada pozo de la última columna. Agregue 100 microlitros de suspensión celular con 150.000 células por mililitro a cada pozo asegurándose de que no haya grumos celulares. Incubar a 37 grados centígrados, 5 por ciento de dióxido de carbono durante 48 horas.
Compruebe si hay sin syncytia con un microscopio de luz. Cuente syncytia en cada pozo de la columna con el factor de dilución más alto que contiene sin syncytia visible. Para los virus que codifican un reportero fluorescente, la sincronía se puede contar mediante microscopía de fluorescencia.
Para el análisis de la cinética de replicación del virus del sarampión un día antes de la semilla de infección 100,000 células vero en 1 mililitro de DMEM con 10 por ciento de FBS por pozo en 12 placas de pared con al menos 2 pozos para cada punto de tiempo de interés. Para infectar las células reemplace el medio con 300 microlitros de medio libre de suero que contienen la cantidad respectiva del virus. Incubar a 37 grados centígrados y 5 por ciento de dióxido de carbono durante al menos 2 horas.
Retire el inóculo y agregue 1 mililitro de DMEM con 10 por ciento de FBS y continúe con la incubación. En los momentos relevantes después de la infección cosecha proginía viral raspando directamente las células en el medio. Transfiera el contenido de cada pozo a un tubo individual.
Congelar en nitrógeno líquido y almacenar a 80 grados Celsius hasta la valoración y luego proceder como se describe en el manuscrito. Para comenzar la evaluación de la citotoxicidad mediada por células inducidas por TEB por liberación de LDH, primero aísle los productos transgén secretos expresados por células diana infectadas por virus y aísle las células de efector inmune como se describe en el manuscrito. Luego sembrar celdas diana en una placa de pared U-bottom 96 e incluir muestras como se describe en el manuscrito.
Añadir inmunomoduladores previamente aislados a las concentraciones deseadas a las muestras respectivas. Agregue las células de desertor inmune a las proporciones deseadas y agregue un volumen medio a un volumen total de 100 microlitros por pozo. Incubar para los marcos de tiempo previamente determinados a 37 grados celsius y 5 por ciento de dióxido de carbono.
45 minutos antes de la recogida de muestras añadir 10 microlitros de 10X Lysis Solution a los pomos que contienen muestras T max y los controles medios correspondientes y continuar la incubación. Centrifugar las células a 250 veces G durante 4 minutos. Transfiera 50 microlitros de sobrenadante de cada pozo a pozos de una placa de pared inferior plana 96 asegurándose de no transferir las células.
Después de preparar la solución de sustrato según el fabricante añadir 50 microlitros a cada pozo. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos o hasta que las muestras T max se vuelvan rojas profundas. Después de la incubación añadir 50 microlitros de solución de parada a cada pocóyo.
Centrifugar durante 1 minuto a 4000 veces G y luego utilice una aguja hueca para eliminar las burbujas de aire. Mida la absorbancia óptica a 490 nanómetros y calcule como se describe en el manuscrito. Después de la inoculación con virus oncolíticos de la contra sarampión no modificados y codificación BTE, las curvas de crecimiento de los vectores comparados en las células vero parecen similares.
Las curvas de viabilidad celular en las células del carcinoma colorrectal murino mc38 expresan de forma estable el antígeno carcinoemblar humano y los receptores MV CD46 después de la inoculación muestran que la actividad lítica del virus de codificación transgén se queda atrás en la línea celular tumoral murina. La citometría de flujo de las células que expresan antígenos diana incubadas con TEB a cinco diluciones diferentes mostró la unión de tes por células de una manera dependiente de la concentración. En inmunoblot después de la extracción magnética hacia abajo de las células asociadas a la EEB mostró que cuando se utilizaron los TEC no targeting no había cantidades detectables de células; mientras que cuando se utilizaban muestras de BTE, se utilizaban células enlazadas en la fracción de elución.
El antígeno objetivo mediado por la TEB de citotoxicidad específica y dependiente de la concentración de células T murinas se indica mediante un ensayo representativo de liberación de LDH y muestra que en el presente ejemplo se logró una matanza celular específica del 15 por ciento a una concentración relativamente alta de TEB de 1 microgramo por mililitro en comparación con las células de referencia. Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar regularmente las células para comprobar la progresión de la infección. No olvides que las cepas de vacunas contra el sarampión recombinantes, aunque atenuadas, pueden ser peligrosas especialmente para las personas inmunosuprimidas.
Evite la exposición siguiendo los procedimientos de biosecuas adecuados. Las personas que manipulen virus deben vacunarse antes de realizar estos métodos. Siguiendo este procedimiento se puede lograr la expresión viral de transgenes adicionales con el fin de analizar las interacciones de los huéspedes del virus y los efectos terapéuticos.
El desarrollo de estas técnicas ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la bioterapia exploren los efectos de los inmunomoduladores expresados localmente en numerosas entidades tumorales;In Vitro, In Vivo, y también en ensayos clínicos.
