Этот метод может помочь решить ключевые проблемы в области иммунотерапии рака, способствуя развитию онколитических векторов для целенаправленной иммуномодуляции. Основным преимуществом применяемой обратной генетической системы является ее универсальность; поэтому векторы могут быть адаптированы для решения различных исследовательских вопросов и нацелены на опухоли с различными иммунными сигнатурами. Шаги распространения вируса, особенно определяющие оптимальную точку времени для сбора вируса, трудно извлечь из текстового протокола, потому что формирование синцитии должно быть оценено визуально с течением времени.
Начать проектирование и клонировать рекомбинантные иммуномодулирующих векторов, как описано в рукописи. В этом протоколе описаны конкретные шаги по разработке онколитической вакцины против кори вектор, кодирующий бисспецифический Т-клеточный энкер. Чтобы спасти вирус кори от кДНА, за 24 часа до трансфекции пластины вируса кори производители клеток равномерно на 6-стенной пластине.
Семя 200 000 клеток в 2 миллилитров DMEM, содержащих 10 процентов FBS на колодец для достижения 65 до 75 процентов слияния во время трансфекции. Смешайте 5 микрограмм рекомбинантных ДНК, кодирующих антигеном вируса кори, который будет использоваться для трансфектации клеток. Соответствующие плазмиды и флуоресцентный репортер в общем объеме 200 микролитров DMEM.
Добавьте в смесь 18,6 микролитров липосомного трансфектального реагента и немедленно слейте трубку, чтобы перемешать. Инкубировать эту смесь трансфекции в течение 25 минут при комнатной температуре. Чтобы заразить клетки производителя MV удалить среду из 6 хорошо пластины выросли до 65 до 75 процентов слияния и добавить 1,8 миллилитров DMEM с 2 процентами FBS и 50 микрограмм на миллилитр Kanamycin на колодец.
Затем добавьте смесь трансфекции dropwise к каждому хорошо и вихрем тщательно. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах по Цельсию и 5 процентов углекислого газа. На следующий день заменить средний с 2 миллилитров свежего DMEM с 2 процентов FBS и 50 микрограммов на миллилитр Kanamycin и повторить это, когда среда становится кислой признается желтым цветом.
Используйте микроскоп для ежедневного наблюдения за клетками для экспрессии генов репортера и формирования синцитии. Когда видна большая синцития, состоящая из 20 или более клеток, или когда клетки становятся слишком плотными, вирус становится слишком плотным. За 24 часа до ожидаемого урожая семян около 1,5 миллиона клеток производителя MV в 12 миллилитров DMEM с 10 процентов FBS на 10 сантиметров блюда для достижения 65 до 75 процентов слияния во время прививки вируса.
Для сбора вируса progyny использовать клеточный скребок, чтобы тщательно соскребать адепта клетки производителя из 6 стен пластины с трансфектными клетками. Перенесите среду, содержащую царапинные клетки, в центрифугу. Центрифуга, по крайней мере 2500 раз G и 4 градусов по Цельсию в течение 5 минут, чтобы удалить клеточный мусор.
После центрифугации смешать безклеточный супернатант с сывороткой свободной среды до конечного объема 4 миллилитров для подготовки инокулума. Удалите среду из 10-сантиметровой тарелки с клетками производителя MV и добавьте инокулум в клетки. Инкубация в течение по крайней мере 2 часов при 37 градусах по Цельсию и 5 процентов углекислого газа.
После инкубации добавьте 6 миллилитров DMEM с 10 процентами FBS и инкубировать клетки на ночь. Затем замените среду 12 миллилитров свежего DMEM с 10 процентами FBS и инкубировать при 37 градусах по Цельсию и 5 процентов углекислого газа до сбора урожая. Наблюдайте за клетками по крайней мере два раза в день.
Перед синцитией лопается, когда нарушение мембраны становится видимым урожай вируса. Для сбора первого прохода снимите супернатант с тарелки и добавьте 600 микролитров сыворотки свободной среды. Затем используйте сотовый подъемник, чтобы очистить клетки и перенести в чистую трубку.
Сразу после этого заморозить вирус подвески в жидком азоте и хранить при 80 градусов по Цельсию, по крайней мере 24 часов, чтобы обеспечить тщательное замораживание. Для определения титеров вирусных запасов в октупликаторах на алицит с использованием 96 настенных пластин. Сначала вытяните клетки производителя из колб культуры клеток T75 в 50 миллилитровую коническую трубку.
Подсчитайте клетки и отрегулируйте подвеску клетки до 150 000 клеток на миллилитр в DMEM с 10 процентами FBS. Добавьте 90 микролитров DMEM с 10 процентами FBS на колодец 96 настенной пластины. Затем добавьте 10 микролитров из одной алициты запасов вируса во все 8 скважин в первой колонке пластины.
Тщательно смешайте, трубя вверх и вниз по крайней мере 10 раз. Используйте многоканальный пипетку для передачи 10 микролитров каждой из них, от первой до второй колонки, и тщательно перемешайте, трубя вверх и вниз. Повторите это для каждой колонки, чтобы получить серийные десятикратные разбавления вируса с помощью свежих пипеток советы для каждого шага разбавления.
Отбросьте 10 микролитров из каждой колодец последней колонки. Добавьте 100 микролитров клеточной подвески со 150 000 клеток на миллилитр к каждому хорошо убедившись, что нет клеточных комков. Инкубация при 37 градусах по Цельсию, 5 процентов углекислого газа в течение 48 часов.
Проверьте синхронизию с помощью светового микроскопа. Подсчитайте синцитию в каждом колодеце столбца с самым высоким фактором разбавления, содержащим видимую синцитию. Для вирусов, кодирующих флуоресцентный репортер, синцития может быть подсчитана с помощью флуоресцентной микроскопии.
Для анализа репликации вируса кори кинетики за день до заражения семян 100 000 веро-клеток в 1 миллилитр DMEM с 10 процентов FBS на скважину на 12 настенных пластин, по крайней мере 2 скважины для каждой точки интереса времени. Для заражения клетки заменяют среду 300 микролитров сыворотки свободной среды, содержащей соответствующее количество вируса. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию и 5 процентов углекислого газа, по крайней мере 2 часа.
Удалить инокулум и добавить 1 миллилитр DMEM с 10 процентов FBS и продолжить инкубацию. В соответствующее время указывает после заражения урожай вирусных progyny путем непосредственного соскабливания клеток в среду. Перенесите содержимое из каждой колодец в индивидуальную трубку.
Заморозить в жидком азоте и хранить при 80 градусах по Цельсию до титрования, а затем продолжить, как описано в рукописи. Чтобы начать оценку индуцированной БТЭ клетки опосредованой цитотоксичности путем выпуска LDH, сначала изолируют секретные трансгенные продукты, выраженные вирусом инфицированных целевых клеток и изолировать клетки иммунного эффекта, как описано в рукописи. Затем семенные клетки-мишени в настенной пластине U-bottom 96 включают образцы, описанные в рукописи.
Добавьте ранее изолированные иммуномодуляторы при желаемых концентрациях в соответствующие образцы. Добавить иммунные клетки перебежчика при желаемых соотношениях и добавить средний общий объем 100 микролитров на колодец. Инкубация для желаемых ранее определенных временных рамок при 37 градусах цельсия и 5 процентах углекислого газа.
За 45 минут до сбора проб добавьте 10 микролитров 10X Lysis Solution в скважины, содержащие образцы T max и соответствующие средние элементы управления и продолжайте инкубацию. Центрифуга клетки в 250 раз G в течение 4 минут. Перенесите 50 микролитров супернатанта из каждой скважины в колодцы плоской нижней 96 настенной пластины, чтобы не передавать клетки.
После приготовления субстратного раствора производитель добавляет по 50 микролитров к каждой колодец. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут или до тех пор, пока T макс образцов свою очередь, темно-красный. После инкубации добавьте по 50 микролитров стоп-раствора к каждой колодец.
Центрифуга в течение 1 минуты при 4000 раз G, а затем использовать выдолбленной иглой для удаления пузырьков воздуха. Измерьте оптическое поглощение на 490 нанометров и вычислите, как описано в рукописи. После прививки с неизмененными и BTE кодирования онколитических вирусов кори кривые роста по сравнению векторов на веро-клеток появляются похожи.
Кривые жизнеспособности клеток на mc38 murine колоректальных клетках карциномы, стабилизирующих карциномбрионный антиген человека и рецепторы MV CD46 после прививки, показывают, что литическая активность вируса трансгенного кодирования отстает в линии опухолевых клеток мурина. Цитометрия потока целевого антигена, выражающая клетки, инкубированные BTE при пяти различных разбавлениях, показала связывание БТЕ клетками в зависимости от концентрации. В иммуноблоте после магнитного стягивания связанных с БТЕ клеток было появь, что при нецелевом использовании БТЕ не было обнаруженного количества клеток; в то время как при таргетинге образцов БТЕ использовались связанные клетки, присутствующие в фракции элюции.
BTE опосредованная целевая антигенная специфическая и зависимая от концентрации цитотоксиситность т-клеток мурина показана репрезентативным анализом выпуска LDH и показывает, что в настоящем примере 15-процентное конкретное убийство клеток было достигнуто при относительно высокой концентрации БТЭ 1 микрограмм на миллилитр по сравнению с эталонными клетками. При попытке этой процедуры, важно помнить, регулярно контролировать клетки, чтобы проверить прогрессирование инфекции. Не забывайте, что рекомбинантные штаммы вакцины против кори, хотя ослабленные могут быть опасны, особенно для людей с ослабленным иммунитетом.
Избегайте воздействия, следуя соответствующим процедурам биобезопасности. Лица обработки вирусов должны быть вакцинированы до выполнения этих методов. После этой процедуры вирусное выражение дальнейших трансгенов может быть достигнуто для того, чтобы проанализировать взаимодействие вирусов и терапевтические эффекты.
Развитие этих методов проложило путь для исследователей в области биотерапии для изучения влияния локально выраженных иммуномодуляторов в многочисленных опухолевых образованиях;In Vitro, In Vivo, а также в клинических испытаниях.
