Bu floresan gümüş boyama içine geleneksel gümüş boyama dönüştürmek için bir florojenik gümüş prob kullanan yeni bir jel boyama yöntemidir. Bu yöntem, aldehitler olmadan basit ve basit bir protokol kullanırken geleneksel gümüş nitrat boyama ve SYPRO Yakut boyama ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş performans gösterdi. Prosedürü gösteren Alex Wong, laboratuvarımdan bir araştırma asistanı olacak.
Bu prosedürü başlatmak için, distile su, LDS tampon ve bir örnek leyici ajan içeren bir çözelti ile protein örnekleri seyreltin. 4-12% Bis-Tris protein jeli ile SDS-PAGE gerçekleştirmek için MES tampon ile dolu bir mini jel tankı ayarlayın. Hazırlanan protein örneği ile kuyular yükleyin, sonra 30 dakika boyunca 200 volt sabit bir voltajda jel çalıştırın.
Elektroforezden sonra, jeli orbital shaker üzerinde etanol ve asetik asit içeren 100 mililitrelik bir çözeltiye batırın ve 50 rpm'de sallayarak oda sıcaklığında 30'er dakika boyunca iki kez kuluçkaya yatırın. Daha sonra jeli 10 dakika süren her yıkama ile temiz bir kapta ultra saf suile üç kez yıkayın. İlk olarak, 0,01 gram gümüş nitratı 10 mililitre ultrasaf suda çözünerek %0,1 konsantrasyona sahip bir stok çözeltisi hazırlayın gümüş nitrat çalışma çözümünü yapmak için 100 mililitre ultrasaf suya 100 mikrolitre stok çözeltisi ekleyin.
Bir duman başlık, mühürlü bir cam odasında gümüş nitrat çalışma çözeltisi 100 mililitre jel batırın. Bir orbital shaker üzerinde 50 rpm sallayarak bir saat boyunca emprenye ve kuluçka sırasında ışık jel korumak için alüminyum folyo kullanın. Bundan sonra, her yıkama yaklaşık 100 mililitre su kullanarak ve 60 saniye süren temiz bir kapta ultra saf su ile jel iki kez yıkayın.
Bu arka plan boyama en aza indirmek için gümüş emprenye adım sonra jel temizlemek için ultrasaf su kullanmak önemlidir. İlk olarak, tpe-4TA boya üç miligram ultrasaf su 50 mililitre ekleyin. Çözeltiyi üç dakika sonicate ve boya çözünmeye yardımcı olmak için her sonication oturumu arasında tek molar sodyum hidroksit çözeltisi beş mikrolitre ekleyin, genellikle üç kez.
Daha sonra boyanın tamamen çözünmesini sağlamak için çözeltinin floresansını 365 nanometrelik uv lambası altında kontrol edin. Sadece zayıf ya da emissive olmayan çözümler tam çözünme gösterir. Florojenik geliştirme solüsyonu hazırlamak için, 90 mililitre ultra saf suya 10 mililitre TPE-4TA stok çözeltisi ekleyin.
Çözeltinin pH'ını kontrol etmek için bir pH ölçer kullanın. PH kapsama alanı dışında ise seyreltilmiş sodyum hidroksit çözeltisi veya asetik asit kullanarak 7 ile 9 arasında bir pH çözeltisini ayarlayın. Daha sonra jeli 100 mililitre florojenik gelişen çözeltiile temiz ve sızdırmaz bir kaba aktarın ve jelin tamamen batırDığından emin olun.
Kabı kapatın ve ışıktan korumak için üzerini kapatın. 50 rpm ve oda sıcaklığında bir yörünge shaker bir gecede konteyner çalkalayın. Jeli temiz bir kapta aktarın ve 100 mililitrelik 10 000 mililitre etanolde 30 dakika boyunca destain.
Daha sonra jeli ultra saf suda beş dakika durulayın. Jel bir tezgah transilluminator üzerinde görselleştirilmiş veya 365 nanometre kanal veya 302 nanometre kanal bir jel dokümantasyon makinesinde görüntülenebilir. Bu çalışmada poliakrilamid jellerde proteinleri lekelemek için yeni bir floresan gümüş boyama yöntemi kullanılmıştır.
Floresan gümüş lekesi ile boyanmış protein bantları 365 nanometreLIK UV lambasının altında yoğun bir yeşillik sergiler. Tüm 14 protein bantları açıkça görülebilir ve sypro Ruby boya ile boyanmış kırmızı renkli bantları ile iyi korelasyon. Bu floresan gümüş boyama yöntemi yüksek çözünürlüğe sahip gibi görünüyor.
Bazı protein bantları için floresan gümüş lekesinin hassasiyeti de floresan SYPRO Ruby lekesinden biraz daha iyidir. Özellikle bu lekenin performansı 10 ila 40 kilodalton arasındaki protein bantları için geliştirilmiştir, bu da yeni yöntemin düşük molekül ağırlığına sahip proteinlerin tespiti için özellikle yararlı olduğunu gösterir. Görüldüğü gibi, veriler aynı zamanda floresan gümüş leke protein nicelik nispeten geniş bir yelpazede tüm 14 proteinler için iyi ve tekdüzelik verdiğini göstermektedir.
Gümüş nitrat lekesi yüksek düzeyde arka plan sinyali ve bozuk zirveler verirken, floresan gümüş lekesi 14 proteinin tüminde SYPRO Ruby lekesi ile karşılaştırılabilecek iyi kontrast ve tek tip yoğunluk dağılımına sahip bantları tespit etti. Yıkama adımları, artık fiksasyon çözümcünün gümüşemprenyesini veya florojenik gelişimi bozmasını sınırlaştırdığı için önemlidir. Gümüş nitrat kullanırken, cilt temasından kaçının.
Dökülmeleri hemen temizleyin. Koruyucu giysi ve eldiven giyin ve kimyasal atık olarak atın.
