Bu protokol, tohumların parçalanmaması için sağlam bir şekilde dilimlenmesine izin verir ve pipet ucuna sığabilecek herhangi bir tohumdaki nişasta granüllerinin görselleştirilmesine izin verir. Dövülebilir plastik koni kuru doku ve organların doğal yapısını destekler, bu nedenle bu ucuz ve kolay manifold birçok numunenin kısa sürede işlenmesini sağlar. Buradaki adli mikroskopi avantajından devam etmek için, dirençli nişasta, hepimizin aradığı bir şey, enzimlerin ham nişastaya, amilolize, glisemik indekse ve glikoz artışlarına erişilebilirliği, bunlar bugün dünya çapında Tip 2 diyabetle savaşmak için daha iyi pirinç çeşitleri yetiştirmek için temel parametrelerdir.
Ve şimdi size Dr. Kiah Barton'ı tanıtmak büyük bir zevk. Dr. Barton bizim laboratuvarımızdan ve bu tekniğin nasıl kullanıldığını göstermek için fakültenin çekirdek görüntüleme tesisini kullanacak. Kuru çekirdekleri kabuklarından arındırarak başlayın.
Bir çalışma tezgahındaki düz bir kauçuk stoperin üzerine tek bir çekirdek yerleştirin ve bu stoperin sabit kaldığından emin olun. Çekirdeği ilk kauçuk durdurucuya doğru bükerek aşındırmak için ikinci bir düz kauçuk durdurucu kullanın, ardından çekirdekteki kabukları çıkarın, endospermi parçalamamaya veya tohumları iki kauçuk maşa arasında çok agresif bir şekilde öğütmemeye dikkat edin. İnce tokmaklar kullanarak kalan kabukları çıkarın ve plastik 250 mikroliter pipet ucuna tek bir kabuklu çekirdek yerleştirin.
Çekirdeğin embriyo ucunun pipet ucunun konik ucuna doğru dönük olduğundan emin olun. Çekirdeği ilk pipet ucuna zorlamak ve kesit sırasında çekirdeği hareketsiz tutmak için ikinci bir 250 mikroliter pipet ucu yerleştirin, çekirdeğe zarar vermemeye veya ikinci pipet ucunu bükmemeye dikkat edin. Pipet ucu montajını bir tezgah üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve elle yerinde tutun.
Öte yandan, çekirdeğin merkezini dilimlemek için keskin bir neşter bıçağı kullanın ve pipet ucunun ucunu kesin. Montaj boyunca aşağı doğru dilimleyin ve ardından neşter bıçağını dikey olarak yönlendirin, böylece el bölümünün iki yeni açık yüzü paraleldir. Daha sonra neşteri pirinç çekirdeğinin bir milimetre kalınlığında bölümlerini kesmek için kullanın.
Yansıyan hafif mikroskopiyi gerçekleştirmek için, enine pirinç bölümlerini bir parça ağır kalibreli siyah kağıda yerleştirin. En az 10 kat büyütme kullanarak eğik aydınlatma için monte kaz tüyüne sahip stereo mikroskop kullanarak enine bölümlerin hafif görüntülerini elde edin. Vahşi tip Nipponbare ve ssg1 bölümleri 260 kez, 920 kez ve 4.200 kat büyütme altında incelendi.
Düzgün bir şekilde hazırlandığında, pirinç bölümleri yaklaşık 0,9 milimetre kalınlığındaydı ve endosperm ve sağlam perikarp ve aleuron katmanlarının minimum parçalanmasıyla. Bu teknik, tüm endosperm hücresini, bileşik nişaste granüllerini ve bireysel granülleri gözlemlemek için yeterli kalitede bölümlerin hazırlanmasını sağlar. Vahşi tip dirençli nişasta hibrid hattı, Zhehui 7954 ve kobalt üretilen mutant RS111 gibi yarı saydam çekirdek üreticileri, normal pirinç endosperm fenotipi olan sıkıca paketlenmiş polihedral nişasta granülleri ürettiler.
Tebeşirli çekirdek üreticilerinin SEM görüntüleri, ticari çeşitlilik Ye Tang ve RS4, yuvarlak ve gevşek bir şekilde paketlenmiş nişasta granüllerini sergiledi. Vahşi tip Xiushiu 11 ve böcek predasyonunu inhibe etmek için Cry1Ab genini ifade eden mutant KMD1, yarı saydam dirençli nişasta çizgilerine benzer bölümlere ve endosperm morfotiplerine sahipti. Bu teknik diğer türlerin tohumlarına uygulanabilir.
Model monocot, Brachypodium distachyon, çok sert tohumlar üretir, ancak yine de sağlam bir enine bölüm elde etmek mümkündü. Bozulmamış enine bölümler de yumuşak, beyaz kış buğdayından üretildi. Biyolojik yapıların içine bakmak için bu hızlı, ucuz tarama yöntemi böcek bacaklarına, çekirge fasulyesi ağacı başaklarına, alıçlara, balık dikenlerine veya bu örnek destek kurulumundan kar edebilecek herhangi bir adli mikroskopi alanına uygulanabilir.
Bu protokolü gerçekleştirdikten sonra elektromikroskop için sputter kaplama, spesifik floresan boyalarla boyama ve mutant yulaf ve arpa hatlarında beta glukan hücre duvar kalınlığı için calcafluor'un lekeye uygulanması, hızlı fenotip taraması ile bitki ıslahı yaklaşmanın bazı hızlı yollarıdır.
