Hücre içi FPOP kütle spektrometresi ile birleştiğinde protein protein etkileşimleri ve canlı hücrelerdeki protein yapısal değişiklikleri incelemek için kullanılan güçlü bir yeni tekniktir. Hücre içi FPOP ile, ilgi proteinleri izole etmek gerekmez, ama yerine kendi doğal ortamlarda onları inceleyebilirsiniz. Bu özellikle membran proteinleri için yararlıdır.
Bu yöntemle, kanser ve genetik bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda yapı ve protein protein etkileşimlerindeki değişiklikleri inceleyebilir, böylece onları daha iyi anlayabilir ve karakterize edebilirsiniz. Akış sisteminin montajına başlamak için, erimiş silika boruyu uygun boyutlarda kesmek için bir dekolte taşı kullanın. Sonra, bir 500 mikrolitre şırınga altı küçük silindirik mıknatıslar yerleştirin ve şırınga doldurun, ikinci bir 500 mikrolitre şırınga, ve kılıf tampon ile iki beş mililitreşli şırınga.
Havayı çıkardıktan sonra, şırıngaları şırınga pompasına yerleştirin ve şırınga pompası durdurucuyu sıkın, böylece motor durduğunda yaklaşık 50 mikrolitre sol hücreşır. Bir yem adaptörü kullanarak, her şırınga için bir manuel vana bağlayın ve gösterildiği gibi silika boru monte, çapraz üzerinden hücre artı hidrojen peroksit silika hattı iplik emin olun ve doğrudan 450 ID silika hattına yerleştirin. Tüm borular bağlandığında, akış sistemini lazerin yanına yerleştirin ve lazer ışınlama için bir pencere açmak için 450 mikrometrelik iç çaplı borudaki silika kaplamayı yakmak için bir çakmak kullanın.
Altı mıknatısiçeren hücre şırıngasının üzerine manyetik bir karıştırıcı yerleştirin ve dakikada 1083,3 mikrolitre lik son akış hızı için şırınga pompasını dakikada 492,4 mikrolitreye ayarlayın. Sistem floş için üç kez sistem üzerinden akış tampon, herhangi bir sızıntı için her bağlantı kontrol. Excimer lazeri silika boruya odaklamak için dışbüvek lens kullanın.
Işınlama penceresini test etmek için, silika borunun arkasına küçük bir kağıt parçası yerleştirin ve lazeri açın. Daha sonra, ışınlama yanmış bölge ölçmek ve sıfır bir dışlama fraksiyonu elde etmek için gerekli lazer frekansı hesaplamak için ışınlama penceresi ve akış hızı kullanın. İşlem için hücreleri toplamak için, uygun bir hücre kültürü sınıf tuz çözeltisi ile% 70 ila% 90 confluent T175 şişe kültüründen hücreleri yıkayın.
Saymak için tampon 10 mililitre hücreleri resuspend ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Hücreleri, akış aşağı analizi için yeterli olduğundan emin olmak için saymak önemlidir, ancak akış sistemini toplamalarına ve tıkamalarına neden olacak çok fazla değildir. Daha sonra iki kez 10 kılıf tampon konsantrasyonu mililitre başına altıncı hücrelere hücreleri yeniden askıya ve örnek başına bir 500 mikrolitre hacmi içine hücreleri aliquot.
Hücre içi FPOP için, taze kılıf tampon ile iki beş mililitreşöf şırınga doldurun, hücrelerin bir aliquot ile mıknatıslar içeren 500 mikrolitreşga, ve taze hazırlanmış ile son 500 mikrolitre şırınga 200 milimolar hidrojen peroksit. Manyetik karıştırıcıyı açın ve 220 mikrolitre dimetil sülfoksiti quench'in bir aliquot'una çevirin. Nazik karıştırma sonra, ışınlanmış örnekleri toplamak ve lazer açmak için akış sisteminin arkasına Quench yerleştirin.
Yedi saniye sonra, akış sistemini açın. Numune akışı bittikten sonra lazeri kapatın ve Quench'i toplanan numuneyle hafifçe karıştırın. Ardından, dört şırıngayı da taze arabellekle doldurun ve tamponu akış sisteminden geçirin.
Sistem kızarma bittikten sonra, hücreler içinde arka plan oksidasyonu için hiçbir lazer kontrolü olarak ışınlama olmadan hücre ve çözeltiler yeni bir aliquot ile işlemi tekrarlayın. Bir sonraki örnek çalışırken, ilk numuneyi santrifüj edin ve uygun bir hücre lisis tamponunun 100 mikrolitresinde peleti yeniden askıya alın. Daha sonra, sıvı nitrojen flaş dondurma için bir mikrocentrifuge tüp örnek aktarın.
Tüm numuneler çalışma tamamlandığında, akış sistemini sökün ve kullanılan silika borularını atın. Daha sonra diğer tüm bağlantıları sonication ile %50 su %50 metanol çözeltisinde bir saat boyunca temizleyin. Standart protokollere göre hücre lysatından proteinleri izole edip sindirdikten sonra, fpop modifikasyonu protium çapında lokalize etmek için sindirilmiş hücre lisatını standart tandem LCMS protokollerine göre analiz edin.
Daha sonra, verileri uygun bir protein analiz yazılımı programına yükleyin ve verileri ilgili protein veritabanı na ve ilgili sindirim enzimine karşı analiz edin. Dosyalar aramayı bitirdikten sonra, ilgi proteini üzerindeki FPOP oksidasyonunun kapsamını hesaplayın. Ortogonal YZ yığılmış görüntülerin floresan görüntüleme lazer ışınlama penceresi geçmiş akar gibi hücre çözeltisi kılıf tampon net bir ayrım gösterir.
Kılıf tampon veya hücre çözeltisi üç boyutlu ortalama ısı haritaları iki çözeltinin en az karıştırma göstermek için oluşturulabilir. Tek hücreli akış sisteminin kullanımı oksidatif olarak modifiye edilmiş protein sayısını 13 kat arttırır. Bozulmamış hücrelerde ilgi proteinlerin modifikasyononaylamak için, floresan görüntüleme hidrojen peroksit tedavisi ve ışınlama sonrasında yapılabilir.
Tandem kütle spektrometresi kullanılarak, bu değişiklikler daha fazla bir protein üzerinde belirli amino asitler lokalize edilebilir. Bu çıkarılan iyon kromatogramında gözlenen kayma, modifiye peptiddeki oksitlenmiş metiyonin in neden olduğu hidrofobiklik değişimine yol açmaktadır. Hücre içi etiketli aktinile in-vitro ayak izi ile karşılaştırıldığında oksidasyon benzer düzeylerde ortaya koymaktadır, aktin hem hücre içi hem de in-vitro çalışmalar için benzer bir çözücü erişilebilirlik olduğunu gösteren.
Ayrıca, iki aktin kristal yapılarından hesaplanan etiketlenmiş artıklar, faiz modifikasyonlarının proteininin hızlı fotokimyasal oksidasyonunun solvent erişilebilirliğine göre karşılaştırılması, ilgi proteininin hücre içi hızlı fotokimyasal oksidasyonunun monomerik proteinin solvent erişilebilirliğini etkin bir şekilde araştırdığını göstermektedir. Bir 2D kromatografi, hücre altı fraksiyonu ve proteomik çoklama teknikleri de dahil olmak üzere alt bol FPOP modifikasyonları, tespitini artırmak için atabileceğiniz birkaç ek adım vardır. Hücre içi FPOP kullanımı ile, artık hücresel fonksiyon ile protein yapıları daha iyi bağlamak için proteomiyostrüel biyoloji gerçekleştirebilirsiniz.
FPOP için gerekli olan 248 nanometre dalga boyu nedeniyle, yansıyan veya dağınık radyasyona istenmeyen maruziyeti önlemek için her zaman UV koruyucu gözlük ve uygun giysiler taktığından emin olun.
