Bu video paralel olarak AML birden fazla aday genleri araştırmak için basit bir yöntem gösterecektir, akış sitometri dayalı rekabetçi büyüme tsay ile birlikte Crisper-Cas9 sistemi kullanarak. Bu tekniğin en büyük avantajı hızlı ve ölçeklenebilir olmasıdır. Prosedürü gösteren Bo Rui Chen, laboratuarımızdan bir post doc olacaktır.
Bir web tabanlı CRISPR tasarım yazılımı ilgi geni için dört ila altı tek kılavuz RNA tasarlamak için kullanılır. Başlamak için, alanlardaki uygun bilgileri yıldız işaretleriyle doldurun. Daha sonra tek kılavuz RNA tasarımı için hedef genomu seçin.
Hedef sırasını sıra kutusuna yapıştırın ve gönder düğmesine tıklayın. İstenilen tek kılavuz RNA ekspresyonu plazmid klonlama için, ters ücretsiz antisense oligonükleotid anlamda oglionükleotid ve AAAC nükleotid CACC prepend. Premix anlamda ve antisense oligonükleotidler sonra bir şirketten sipariş edilir 96 iyi plaka, Oligo Mix etiketli.
Ayrı bir U-Bottom 96 kuyu plakası, Annealing Plaka etiketli ayarlayın. T4 polinükleotid kizaz bir mikrolitre ana karışımını hazırlayın, 10x T4 DNA ligasyon tampon bir mikrolitre, ve annealing reaksiyon başına su altı mikrolitre. Annealing Plaka her kuyuya ana karışımı 8 mikrolitre ekleyin, premix anlamda ve antisense oligonükleotid2 mikrolitre takip.
Pipet iki ila üç kez yavaşça iyice karıştırın ve sonra kuyuların dibine karışımları almak için kısa bir süre plaka spin. Bir PCR makinesinde aşağıdaki annealing programını kullanın. 30 dakika boyunca 37 santigrat derece, iki dakika ve 30 saniye boyunca 95 santigrat derece, saniyede 0.1 santigrat derece hızında 22 santigrat derece yavaş soğutma izledi.
Annealing tamamlandığında, su ile 200 annealing reaksiyon1-200 fosforlu ve annealed oligonükleotidseyrelterek, Seyreltilmiş Oligo Mix etiketli taze bir 96 kuyu plaka sıyrık. Tek kılavuz RNA ekspresyon vektörü, 1,5 mikrolitre BBS1 restriksiyon enzimi ile vektörün beş mikrogramını sindirerek, 37 santigrat derecede iki saat boyunca uygun bir tampon kullanarak doğrusallaştırın. Sonra, yeni bir almak 96 iyi plaka Ligation Plaka etiketli, ve BBS1 sindirilmiş tek kılavuz RNA ifade vektörü 20 nanogram eklemek bir iyi her istenilen tek kılavuz RNA ligasyon.
Buna seyreltilmiş Oligo Mix plakasından 2 mikrolitre fosforilasyonlu annealize oligonükleotid ekleyin. Her kuyuya, bir mikrolitre 10X T4 ligaz tamponu ve bir mikrolitre T4 ligaz enzimi ekleyin ve yavaşça pipet karıştırın. Tabağı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın.
Ligasyon reaksiyonu bitmeden yaklaşık 10 dakika önce, 90 mikrolitre kimyasal olarak yetkin E.coli hücrelerini buz üzerinde doldurun. Ayrı bir 96 kuyu plakasının her bir kuyuya yetkili hücrelerin 10 mikrolitre aliquots aktarın. Yetkili hücreleri içeren kuyulara ligasyon karışımı ekleyin.
Pipet yavaşça yukarı ve aşağı, ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Pipet bakteri DNA karışımı her dönüşüm reaksiyondoğrudan bir kuyu içine 6 kuyu plaka, ampisilin mililitre başına 100 miligram lb agar içeren. Her kuyuya yaklaşık 5-8 cam boncuk ekleyin ve dairesel bir hareketle 6 kuyu plakasını 8-10 kez sallayın.
Plakaları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, steril 20 mikrolitre lik pipet ucu ile her kuyudan bir ila iki tek koloni seçin ve steril 10 santimetre petri kabında etiketli bir noktaya çizgi, LB agar ve mililitre başına 100 miligram ampisilin ile LB plakaüzerine streaking sonra, 14 mililitre yuvarlak alt tüp içinde ampicillin orta üç mililitre içine ucu çıkarmak , ilgili bakteriyel klon numarası ile işaretlenir. Bakteriyel plaka daha sonra doğrudan Sanger sıralama için gönderilir.
Klonlanmış tek kılavuz RNA'ların sıralı bir teyidinden sonra, üreticinin talimatlarına uygun bir miniprep kiti kullanarak, ilgili 14 mililitrelik tüpten DNA'yı arındırın. Tek kılavuz RNA lentiviral parçacıklar metin protokolünde açıklandığı gibi, 96 iyi formatta üretilmektedir. Ve viral süpernatant hemen eksi 80 derecede dondurulur.
AML Cas9 hücrelerinde tek kılavuz RNA'ların transdüksiyonundan bir gün önce, mililitrede 10 mikrogram konsantrasyonda 100 mililitre rekombinant insan fibronektin parçası ile düz bir alt doku dışı kültür 96 iyi plaka tedavi edilir. Buharlaşma kaybını önlemek için plakayı sargı sargı ile sarın ve bir gece boyunca bankta bırakın. Ertesi gün, 96 kuyu plaka her kuyudan rekombinant insan fibronektin parçası çıkarın.
Oda sıcaklığında her bir kılavuz RNA viral supernatant çözülme. Transdüksiyon plakasının her kaplanmış kuyusu için her tüpten 50 mikrolitre viral süpernatant ekleyin. Santrifüj sırasında olası kirlenmeyi önlemek için plakayı yapışkan sargı ile sarın.
90 dakika boyunca 35 santigrat derece de 1, 300 kez g plaka spin. Spenfeksiyon sonuna doğru, kültür şişesinden klon B3 hücrelerini ifade eden yüksek Cas9'u sayın. Saydıktan sonra, gerekli sayıda hücreaşağı spin ve taze ortamda resuspend.
90 dakikalık spinfection'ten sonra, plakayı yavaşça yatırarak süpernatantı tüm kuyulardan çıkarmak için 50 mikrolitreye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanın. Her iyi yavaş yavaş, jant aşağı kayan, klon B3 hücrelerinin kültürünün 100 mikrolitre ekleyin. Hücreleri dibe yerleşmek için iki dakika boyunca 35 santigrat derece de 1, 300 kez g plaka spin.
Plakayı 37 santigrat derece doku kültürü sınıfı kuluçka makinesine aktarın. Ertesi gün, tek kılavuz Lure transduced hücreleri içeren her kuyuya 100 mikrolitre taze ortam ekleyin, böylece son orta hacmi 200 mikrolitredir. Tabağı kuvöze geri ver.
Transdüksiyondan 72 saat sonra, akış sitometrisi ile her kuyuda BFP pozitif hücreler içeren tek kılavuz RNA yüzdesini kontrol edin. Ölü hücreleri analizden işaretlemek ve dışlamak için hücre canlılığı boyası kullanın. Tahlil sırasında aşırı büyümeyi önlemek için her olgu analizinden sonra hücrelerin bir kısmını taze ortamla yeni kuyulara yeniden kaplamaya devam edin.
Her iki ila üç günde bir, BFP pozitif hücrelerin bfp negatif karşıtlarına göre göre göreli oranını kontrol etmek için gerçekler analizini tekrarlayın. Olgu analizi yazılımını kullanarak her zaman noktası için BFP pozitif hücrelerinin yüzdesini analiz edin. Rekabetçi çoğalma tsay başarısının anahtarı nihai canlı hücre numaraları doğru olduğundan emin olmak için uygun gating teknikleri kullanmaktır.
Her örnek için FCS dosyalarını yazılıma sürükleyin. Herhangi bir örnek dosyaya çift tıklayın ve x ekseninde ileri dağılım ve y ekseninde yan dağılım ile ileri dağılım ayarı çizin. Tüm hücreleri kapıla.
Kapılı hücrelere çift tıklayın ve y ekseninde canlılık lekesini öne doğru dağılım yüksekliğine veya alan nokta çizimine göre çizin. Canlılık lekesi negatif hücreleri kapa. Geçitli canlı hücrelere çift tıklayın ve x ekseninde y ekseninde ve ileri dağılıma karşı BFP'yi çizin.
BFP pozitif hücreleri açın. Seçili örneği grup sekmesi altındaki tüm örneklere sürükleyerek tüm bu kapıları tüm örneklere uygulayın. Tüm örneklerin analiz tablosunu yapmak için tablo düzenleyicisine tıklayın.
BFP pozitif sayısını bir örnekten tabloya sürükleyin ve tablo düzenleyicisi'ndeki ekran düğmesini tıklatarak tüm örneklerin toplu raporunu oluşturun ve tablo BFP pozitif hücrelerin yüzdesini görüntüler. Tabloyu excel dosyası olarak kaydedin. Bu sistem, insan ve murine AML hücre hatlarının yayılmasında veya hayatta kalmasında rol oynayabilecek genlerin rolünü araştırmak için kullanılmıştır.
AAVS1 güvenli liman lokusunun iki ayrı tek kılavuz lu RNA'ların insan MOM13 Cas9 hücrelerinin çoğalması üzerinde hiçbir etkisi olmadığı, buna karşılık, DNA replikasyonu ile ilişkili gen RPA3 hedeflendiğinde, BFP pozitif hücrelerinin yüzdesinde BFP negatif untransduced muadillerine göre ilerleyici ve anlamlı bir düşüş gözlenmiştir. Benzer şekilde, bir epigenetik regülatör olan Dot1l'i ve göz pigmentasyon geni Rodopsin'i hedefleyen tek kılavuz RNA'ların etkileri fare MLL-AF9 Cas9 hücrelerinde test edildi. Dot1l hedefleyen tek kılavuz RNA'lar, Rodopsin'i hedefleyen tek kılavuz RNA'ların aksine rekabetçi çoğalmada dramatik ve ilerici bir düşüş göstermiştir.
Bu sonuçlar, daha önce yayınlanmış sonuçları doğrulayan, Dot1l tükenmesine kitle lösemi hücrelerini ifade eden MLL-AF9'un savunmasızlığını göstermektedir. Gen başına dört ila altı kılavuz RNA varsayarsak, bu yöntem de paralel olarak en az 16-24 gentest için kullanılmak üzere uygundur, ve aynı zamanda herhangi bir kanser hücresi hattında gen bağımlılıkları test etmek için uygulanabilir. AML hücrelerinde test edilmesi gereken moleküler yol gibi daha fazla sayıda gen olması durumunda, CRISPR-Cas9 tabanlı ekranlar daha yararlı olacaktır.
