Ekstrasellüler Veziküller giderek birçok alanda tanısal biyomarker ve potansiyel tedavi aracı olarak kullanılmaktadır. Akış Sitometrik takım elbise yüzlü işaretçilere göre karakterize etmek için en düz ileri analitik yöntemdir bu protokol bir boyutlandırılmış parçacığın analizinde kullanılabilir, hızlıdır ve özel ayarına veya özel alete gerek kalmadan geleneksel sismometreler için geçerlidir. Bu protokol, ekstrasellüler vezikülleri belirtilen durum ve ortamdan ayırmak için kullanılmasına rağmen, hastalarda invaziv doku biyopsilerinin yerine, gelen kanın kategorize edilmesine doğru genişletilebilir.
Protokole yeni başlayan araştırmacılar için kurulum yöntemi bölümünde açıklanan adımları gerçekleştirmek ve pbs'de 55 santimetre karelik Petri-tabakları %02 domuz derisi jelatini ile kaplayarak elde etme stratejilerini yakından takip etmek önemlidir. 15 dakika sonra, iscove's Modifiye Dulbecco's Medium veya IMDM, % 20 fetal sığır serumu ile desteklenen ve 37 derece santigrat derece ve% 5 karbon dioksit onların kuluçka için% 1 penisilin ve streptomisin ile desteklenen her çanak üzerine çanak ve plaka 4.4 kez 10. Hücreler yaklaşık % 80 biraraya geldiğinde, kalsiyum ve magnezyum olmadan Dulbecco PBS ile iki kez kültürleri yıkayın ve serum ücretsiz ekzozom üretim ortamı 10 milileters ile hücreleri beslemek.
7 gün sonra, havuz her plaka dan klimalı orta, tek bir polipropilen santrifüj tüp içine ve herhangi bir hücre enkaz kaldırmak için orta santrifüj. Supernatent'i 100 kilodalton santrifüj filtre tüpüne aktarın ve temizlenmiş, şartlı, orta yı ek bir santrifüjle yoğunlaştırın. Son bir tezgah üstü santrifüj için bir mikro santrifüj tüp içine konsantre aktarın ve bir polikarbonat kalın duvar mikro santrifüj tüp içine supernatent ekleyin.
Tüpü PBS ile doldurun, son hacmi 3,2 milileters için, ve titanyum sabit melekli rotor içine örnek yükleyin. Daha sonra rotoru ultrasantrifüj için bir masa üstü ultracentrifuge'a yükleyin ve peleti 100 mikrolitre taze PBS'de yeniden askıya alın. Nanopartikül izleme ve analiz nicelemesi için, 999 mikrolitre PBS'de ultrasantrifüjlü numunenin 1 mikrolitresini seyreltin ve numuneyi kabarcıksız 1 milileter şırıngasına yükleyin.
Şırıngayı muayene odasının giriş noktasına yükleyin ve lazeri açın. Kamerayı açmak ve odağı ayarlamak için yakalama düğmesini kullanın. Ardından, her biri 60 saniyelik en az üç farklı kare kaydedin ve üç farklı satın almayı analiz etmek için yazılımdaki toplu işlem seçeneğini kullanın.
Satın alma için örnek hazırlamak için, ilk bir mikro santrifüj tüpü içine, 1:1:1 oranında uygun deneysel monoklonal antikor konjuge yakalama boncuk ekleyin ve elde edilen yakalama boncuk havuzu girdap. Daha sonra, 1 mikrolitre yakalama boncuk havuzuna uygun numune hacmini ekleyerek 8 parçacıka 10 katı artı test konsantrasyonu başına 5.boncuk sayısına 1.2 kat 10 oluşturun. Negatif kontrol olarak boncuk etiketli bir tüp e 1 mikrolitre boncuk ekleyin ve taze PBS ile 100 mikrolitre her tüp hacmini ayarlayın.
Sonra bir termo mikser tüpler yerleştirin, sallayarak, dakikada 400 rotasyonlar, ve 4-10 Santigrat, bir gecede. Ertesi gün, yuvarlak bir alt 96 iyi plaka örnekleri aktarın ve her kuyuya uygun floresan konjuge antikorlar ekleyin. 4 ila 10 santigrat derece bir 1 saat kuluçka sonra, her kuyu için PBS 100 mikrolitre ekleyin ve satın alma yazılımı açın.
Aleti başlatmak ve yeni bir deneme açmak için sitometre yi ve sistem başlangıç programını seçin. Deneysel bir şablon oluşturun ve plakayı seçin ve plaka ekleyin. Plakadaki örneklerin konumunu seçin ve örnek olarak ayarla'yı tıklatın.
Adlandırma kurallarına örnek adı girin, kanal sekmesini açın ve uygun floresan sinyal kanallarını seçin. Şimdi plakayı alete yükleyin. Ve nokta çizimi, yan dağılım alanı nokta çizimkarşı yeni bir ileri dağılım alanı oluşturmak için tıklatın.
Lazer ve akışkanbaşlatmak için başlat'ı seçin ve satın alma başlatmak için çalıştır'ı tıklatın. Ölçeği, ileri ve yan dağılım çiziminin ortasındaki popülasyonu göstermek için ayarlayın ve enkazı dışlamak için tüm örnek popülasyonun etrafına bir boncuk kapısı çizin. İleri dağılım yüksekliği ne kadar ileri dağılım alanı nokta çizimi oluşturmak için dur ve nokta çizimini tıklatın ve örneği boncuk popülasyonuna kapama.
Büyük nüfus etrafında yeni bir kapı çizin ve Singlets adını ve kullanılan deneysel florofor başına, yan dağılım alanı nokta arsa karşı bir floresan sinyal oluşturmak için nokta çizim tıklayın. Singlets yeni nokta arsa kapısı. Ardından kaydedilecek olay sayısını seçin ve deneysel edinimi başlatmak için kaydı seçin.
Analizin sonunda, edinme dosyalarını uygun analiz yazılımına yükleyin ve yeni bir protokol açın. Her dosya için yalnızca gösterildiği gibi nokta çizimleri oluşturun ve tüm dağılım eksenini doğrusal ölçek ve floresan eksenin tümünün günlük ölçeğine ayarlayın. Daha sonra, farklı hücre dışı vezikül preparatlarında, ortalama floresanyoğunluğundaki tam değişimi hesaplamak için, ilgili sinyal kanallarındaki floresan geometrik ortalamayı gösterin.
Ortalama floresans yoğunluğu eğrisinin erken üstel fazına ulaşmak için en küçük toplam hücre dışı vezikül miktarını ayarlamak için farklı koşullar test edildikten sonra, en az partikül sayısının 1 çarpı 10 ile 8 partikül arasında olduğu belirlenmiştir. Spesifik olmayan antikor bağlama olmadan en yüksek sinyali elde etmek için 8 partiküle 1 kez 10 için en uygun antikor konsantrasyonu, hem anti CD9_FITC hem de anti CD63_PE antikorları için mililitre başına 10 mikrogram ve anti CD81_PE antikor için mililitre başına beş mikrogram olarak belirlendi. Yöntemin uygunluğunu doğrulamak için, fincan şeklindeki hücre dışı vezikülleri analiz etmek için, membran enkazı değil, hücre dışı veziküller sonicated edildi, ortalama floresans yoğunluğunda bir azalma ile sonuçlanan, sonication kadar az 30 saniye sonra, mekanik bozulma bir dakika sonra hiç floresan salgılanan ile.
Gösterildiği gibi kardiyak progenitor hücrelerinden X kendi saflaştırma, ekstrasellüler veziküller verir, CD9 düşük düzeyde ve CD63 ve CD81 yüksek düzeyde her iki hücre popülasyonlarından ifade. Ayrıca, X'in kendi yüzey belirteçleri ultrasantrifüj olmadan açıkça tanımlanabilir olsa da, bu zenginleştirme adımı bu belirteçlerin ortalama floresan yoğunluğunu büyük ölçüde artırır. Ekstrasellüler veziküller ile çalışırken, daha dikkatsiz nano parçacık pelet kolayca cevapsız olabilir.
Bu nedenle, protokolde gösterildiği gibi tüm adımı takip etmek esastır. Bir biyomarker olarak ekstrasellüler veziküller kullanarak şimdi en gelişmekte olan alan araştırma biridir. Ve yakında, alternatif bir tarama aracı olarak kullanılan klinik tanıya çevrilebilir.
