Mevcut zimografik teknikler proteazsınırlı sayıda tespit. Floresan peptid zimografide floresan peptidler daha geniş bir proteoz aralığının ölçülmesini sağlayan bozunabilir substrat olarak kullanılır. Bu yöntemin en büyük avantajı modüler tasarımıdır.
Floresan peptid dizisi hangi proteazların tespit edilip tespit edilgenolduğunu belirler ve floresan peptid kolayca farklı bir dizinin peptidi ile değiştirilebilir, diğer proteazlar tespit etmek için bir yetenek. Bu teknik, peptidlerin ilaç dağıtımı veya doku mühendisliği uygulamaları gibi mühendislik biyomalzemelerde bozunabilir çapraz bağlayıcılar olarak kullanılmasının tasarımını bilgilendirmeye yardımcı olabilir. Bu peptidin bu teknikle birleştirilmesi, biyomalzeme bozulmasından sorumlu doku salgılanan proteazları belirleyebilir.
Bu tekniğin gösterilmesi, diğer zimografi tekniklerine göre benzersiz olan çok katmanlı yaklaşımı görselleştirmek için önemlidir. Bu tekniği gösteren, Ameya Deshmukh, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Başlamak için, metin protokolütabloda belirtildiği gibi% 10 poliakrilamid çözme jel çözüm ünü hazırlamak.
Jeli dökmeden hemen önce TEMED ve APS'yi ekleyin. Daha sonra, 1,5 milimetrelik mini jel kaseti çözücü jel çözeltisi ile yarıya kadar doldurun ve boşaltın. Bir seviye jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için poliakrilamid jel üstüne izopropanol ince bir tabaka ekleyin.
Polimerizasyon reaksiyonunun ilerlemesini izlemek için artık poliakrilamid çözeltisini kullanın. Tüpteki poliakrilamid tamamen katılaştırDığında reaksiyon tamamlanır. İlk çözücü jel tabakası polimerize olurken, Azido-PEG3-Maleimide kitini 20 santigrat dereceden depodan alın ve bileşenlerin oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin.
Daha sonra, üretici dmso önerilen hacmi şişe iki bileşenleri eritin. Ve sıvıların iyice karışmasını sağlamak için 30 saniye boyunca girdap. Şişe bir içeriğini temiz, kuru 100 milileter yuvarlak alt şişe içine bir karıştırma çubuğu içeren aktarın.
Hemen şişenin ağzına bir şırınga ile delinebilir bir diyafram ile kauçuk septum stoper takın. Sonra, diyafram içine iki 18-gauge şırınga iğnesi takın. Şırınga iğnelerinden birini inert bir gaz tankına bağlayın ve gazın yuvarlak alt şişeyi üç dakika boyunca doldurmasına izin verin.
Sonra, inert gazı kapatın ve iğneden ayırın. Bir şırınga kullanarak, şişe iki tam içeriğini şişe içine enjekte. İğneleri ve şırıngayı da çıkarın.
Karıştırma sırasında oda sıcaklığında 30 dakika karıştırmak için bileşenleri bekleyin. Bundan sonra kauçuk septum durdurucu çıkarın ve temiz bir beş mililitre centrifuge tüp içeriğini aktarın. Bir kez ilk çözücü jel tabakası polimerize vardır izopropanol tabakası dökün.
Jel üstüne de-iyonize su bir mililitre Pipet ve sonra jel durulamak için su dökün. 80 santigrat derecede depolama dan tiyol fonksiyonel floresan peptid alın. Oda sıcaklığında erimesine izin verin.
Metin protokolünün birinci tablosunda belirtildiği gibi Azido-PEG3-Maleimide bağlayıcı molekülü ve floresan peptid içeren %10'luk bir çözüm lüzumlu bir jel çözeltisi hazırlayın. Jeli dökmeden hemen önce TMED ve APS ekleyin. Daha sonra, jel kasetin kalan kısmının yarısını peptit çözümlü jel çözeltisi ile doldurun.
Bir seviye jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için poliakrilamid jel üstüne izopropanol ince bir tabaka ekleyin. Polimerizasyon reaksiyonunun ilerlemesini izlemek için artık poliakrilamid çözeltisini kullanın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, izopropanol tabakası dökün.
Jel üstüne de-iyonize su bir mililitre Pipet ve sonra jel durulamak için su dökün. Jelleri hemen kullanmıyorsanız, 100 mililitre 1x PBS ile dolu plastik bir kutuya daldırarak saklayın. Fotobeyaztma önlemek için alüminyum folyo kutuyu sarın.
İlk olarak, metin protokolütabloda özetlenen% 5 istifleme jel çözüm ünü hazırlayın. Jeli dökmeden hemen önce TMED ve APS ekleyin. Jel kasetin kalan boş kısmını istifleme jeli çözeltisi ile doldurun.
Hızlı bir şekilde istifleme jel tabakası içine bir 1.5 milimetrelik jel tarak tarak eklemek hiçbir kabarcıklar kuyuların altında sıkışıp kalmasını sağlamak. Polimerizasyon reaksiyonunun ilerlemesini izlemek için artık poliakrilamid çözeltisini kullanın. Reaksiyon tamamlandığında, tarak ve bandı jel kasetin inarkasından yavaşça çıkarın.
Başlamak için, geleneksel zimografi örnek tampon örnekleri çözün. Jel cihaza tampon çalışan 400 mililitre os 1X tris glis glis sds ekleyin. Kuyu başına 35 mikrolitreye kadar numune yükleyin.
Numuneleri 1,5 saat boyunca veya molekül ağırlığı standartları, ilgi proteazlarının peptid çözme jel tabakası içinde olduğunu gösterene kadar dört santigrat derecede 120 voltta çalıştırın. Bundan sonra, plastik kaset jelleri çıkarın. Jelleri oda sıcaklığında hafif ajitasyon altında yeniden olgunlaşma tamponu içinde üç kez yıkayın.
Her yıkama ile, 10 dakika sürer. Jelleri 15 dakika boyunca gelişmekte olan bir tampon çözeltisine aktarın. Daha sonra 24 saat boyunca nazik ajitasyon altında 37 santigrat derecede taze gelişen tampon ve kuluçka ile çözüm değiştirin.
Bundan sonra, jelleri görüntülemek için uygun uyarma ve emisyon filtreleri ile bir floresan jel tarayıcı görüntüleyici kullanın. Floresan proteaz bozunabilir peptidler için bu çalışmada poliakrilamid jeller dahil edilmiştir. QGIW hücresel kollagenezi tespit etmek için tasarlanmış bir kollajen bir türemiş dizi, LACW MMP-14 ve MMP-11 tespiti için optimize edilmiş bir dizi ise.
Floresan görüntüleme LACW peptid jelleri içinde çok sayıda bantları ortaya koymaktadır, QGIW jelleri sadece tek bir bant görülür iken. Jelatin zimografi ile karşılaştırıldığında, LACW jelleri daha proteolitik bantları tespit edebiliyoruz, hangi peptit zimografi yeteneğini gösteren yerli substratlar kullanarak geleneksel yöntemlerden daha biyolojik örnekler içinde mevcut proteazlar daha geniş bir yelpazede tespit etmek. Peptit zimografi hücreleri daha sonra gm6001, geniş spektrumlu MMP inhibitörü veya genel bir kathepsin inhibitörü olan E64 içeren geliştirme tamponunda kuluçkaya yatırılır.
LACW peptid jellerinin GM6001 ile tedavisi, bantların yoğunluğunu azaltır. E64 ile tedavinin fark edilebilir bir etkisi yoktur. QGIQ peptid jellerinin GM6001 ile tedavisi daha önce görülen bantların tam ablasyonile sonuçlanmasına neden olabilir.
E64'ün bir etkisi yoktur. Jelatin zimografi, peptid zimografisinin duyarlılığını mevcut altın standartla karşılaştırmak için saflaştırılmış, aktif MMP-9 kullanılarak yapılır. LACW jelleri MMP-9 en küçük konsantrasyonları tespit edebiliyoruz.
Proteazlar yeniden doğaya yeniden yapmak ve aktif hale gelmek için özel koşullar gerektirir. Kompozisyonun ve PH'nin doğru olduğundan emin olmak için arabellek çözümlerini dikkatlice hazırlayın. Bu yöntem, kimlik doğrulamak ve ölçülen proteazlar daha fazla analiz gerçekleştirmek için mevcut teknikler ile tamamlanabilir.
Bu batı blot, gerçek zamanlı PCR ve kütle spektrometresi içerir. Poliakrilamid kullanırken dikkatli olun. Polimerize olmayan çözelti güçlü bir nörotoksin olarak kabul edilir ve uygun kişisel koruyucu ekipman her zaman onu kullanırken giyilmelidir.
