Çok parametreli akış sitometri protokolümüz, kanser biyolojisi ve terapisinde devam eden çalışmaların bir koşulu olan tümör hücrelerinde tedaviye bağlı yaşlanmanın hızlı ve gelişmiş bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Akış sitometrisi yaşlanma tahlilimiz mevcut mikroskopi tabanlı tahlillerden daha hızlıdır. Yaşlanan hücreleri tanımlamak için sadece bir yerine iki belirteç kullanıyoruz ve tahlil güvenilirliğini artırıyoruz.
Hücreler, ilgilenilen ek hedefleri tespit etmek için floresan antikorlarla birlikte boyanabilir. Akış sitometrisi sıralama, aşağı akış analizi için yaşlanan hücre popülasyonlarını zenginleştirmek için kullanılabilir. Tahlil, kültürlenmiş kanser hücresi hatlarında veya nazik ayrışmadan sonra tüm tümör örneklerinde yaşlanan hücreleri tespit edebilir.
Bu tekniği denemeden önce, kullanılan akış sitometresinin genel çalışma prosedürlerine aşina olmak önemlidir. Önerilen akış sitometresi spesifikasyonları için lütfen metne bakın. İlaçlarla yaşlanma indüksiyonundan bir gün önce, kanser hücre hattı kültürünü% 0.25 tripsin EDTA ile hasat edin.
Tripsini aktive etmek için hücreleri beş dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin ve hücre monokatmanını ayırın. Tek katman gözle görülür şekilde ayrıldığında, eşit miktarda tam kültür ortamı ekleyerek tripsin nötralize edin. Hücre süspansiyonunu steril bir konik tüpe aktarın.
Standart hemositometre yöntemini kullanarak hücreleri sayın ve mililitre başına hücreleri kaydedin. Plaka hücreleri, standart altı delikli plastik bir kültür plakasında santimetre kare başına bir kez 10 ila üçüncü ila 10 kez 10 ila üçüncü hücreler. Plakayı gece boyunca% 5 karbondioksit ve nem ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, hücreleri etoposid gibi yaşlanmaya neden olan ajanla tedavi edin. Daha sonra yaşlanmanın başlamasına izin vermek için dört gün boyunca kuluçkaya yatırın. Beklenen morfoloji değişiklikleri için hücreleri günlük olarak bir ışık mikroskobu altında inceleyin.
Yaşlanmanın başlamasından sonra, 37 santigrat derecede beş dakika boyunca tripsin EDTA ekleyerek hücreleri toplayın. Hücreler süspansiyona ayrıldığında, tripsini eşit hacimli bir tam ortam ile nötralize edin. Hücre süspansiyonunun her bir kuyucuğunu 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Hücreleri tekrar sayın ve numune başına eşit sayıda hücreyi yeni bir tüp kümesine aktarın. Tüpleri dört santigrat derecede 1.000 g'da beş dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. İlk olarak, DMEM'de bir mikromolar bafilomisin A çözeltisini, mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 ila bir konsantrasyonda hücre peletine ve karıştırılacak pipete ekleyerek kültürlenmiş hücre numunelerinin lizozomal pH'ını ayarlayın.
Yavaş bir hızda bir rotatörde 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz için lekelemek için, yıkamadan numunelere mililitre başına 10 mikrogramda DDAOG stok çözeltisi ekleyin. Doğrudan ışıktan korunan 60 dakika boyunca bir rotatöre yerleştirin.
Daha önce olduğu gibi, tüpleri santrifüj edin, süpernatanı çıkarın ve peleti PBS'de bir mililitre buz soğuk% 0.5 BSA ile yıkayın. Daha sonra yıkanmış hücre peletlerine 300 mikrolitre seyreltilmiş Calcein Violet 450 çözeltisi ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Hücre örneklerini akış sitometrisi cihazı uyumlu tüplere aktarın. Veri toplama yazılımında, bir mor kanal histogramı ve yeşil kanal nokta grafiğine karşı uzak kırmızı bir kanal açın. Düşük bir alım hızında sitometre veri toplamayı başlatın ve DDAOG ile boyanmış pozitif kontrol örneklerini giriş portuna yerleştirin.
Örnek verileri almaya başlayın. Kanal voltajlarını, olayların %90'ından fazlası her grafikte yer alacak şekilde ayarlayın. Tüm ayarlar en uygun olduğunda, örnek başına 10.000 olay kaydedin.
DDAOG ile lekelenmiş yalnızca araca özel kontrol numunelerini giriş portuna yerleştirin. Veri toplamayı başlatın ve örnek başına 10.000 olay kaydedin. Pozitif kontrole karşı otofloresan veya AF ve DDAO-galaktosid sinyalinde bir artış olup olmadığına bakın.
Örnek verileri fcs dosya biçiminde kaydedin ve dosyaları akış sitometrisi analiz yazılımı ile donatılmış bir iş istasyonu bilgisayarına aktarın. Sitometri veri analiz yazılımını kullanarak, alınan tüm örnekler için fcs veri dosyalarını yükleyin. İlk olarak, uygulanabilir hücreleri geçmek için, veri penceresini açmak üzere yalnızca araç denetiminin örnek verilerine çift tıklayın.
Verileri mor kanal histogramı olarak görselleştirin. CV 450 ile boyanan, boyanan canlı hücreler, ölü hücrelerden daha parlak floresanlarına dayanmaktadır. Tek Geçitli Histogram aracını kullanarak yalnızca uygulanabilir hücreleri içerecek şekilde bir kapı çizin.
Kapıyı Uygun olarak adlandırın. Ardından, kapıyı düzgün bir şekilde uygulamak için Viable geçidini örnek düzen penceresinden diğer hücre örneklerinin üzerine sürükleyin. Mizanpaj penceresini açın.
Düzen penceresinde, tüm örnekleri mor kanal histogramları olarak görselleştirin. Uygulanabilir hücre geçidinin numuneler arasında uygun olduğunu doğrulayın. Değilse, gerektiği gibi ayarlayın.
Ardından, yaşlanan hücreleri geçmek için, veri penceresini açmak üzere yalnızca araç denetiminin kapılı uygulanabilir hücre verilerine çift tıklayın. Ardından, verileri yeşil kanala karşı uzak kırmızı kanal için bir nokta grafiği olarak görselleştirin. Dikdörtgen Geçit aracını kullanarak sağ üst kadrandan DDAO pozitif ve AF pozitif hücrelerin %5'inden azını içerecek şekilde bir kapı çizin.
Kapıyı Sensest olarak adlandırın. Ardından, kapıyı düzgün bir şekilde uygulamak için Senescent geçidini örnek Mizanpaj penceresinden tüm örneklerin uygulanabilir alt kümesine sürükleyin. Mizanpaj penceresine, tüm uygun hücre kapılı alt kümeleri sürükleyip bırakın.
Tüm uygulanabilir örnekleri uzak kırmızı ve yeşil kanal nokta grafikleri olarak görselleştirin ve sonuçları gözlemleyin. Yaşlanan kapının tüm arazilerde görünür olduğundan ve yalnızca araç kontrolleri için kapının% 5'ten daha az yaşlanan hücre gösterdiğinden emin olun. Analiz artık tamamlandı.
Veriler artık grafik ve tablo formatında istenildiği gibi dışa aktarılabilir. Tedavi edilmeyen hücrelerle karşılaştırıldığında, etoposid tarafından indüklenen yaşlanan B16-F10 melanom hücreleri, X-gal'in yüksek yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz ile bölünmesi nedeniyle genişlemiş morfoloji ve mavi boyama sergilemiştir. Etoposit ile muamele edilmiş hücrelerin floresan C12FDG veya DDAOG ile boyanması, X-gal ile karşılaştırılabilir boyama paternleri ve yoğunluk varyasyonları göstermiştir.
Bununla birlikte, yeşil C12FDG emisyonu ile örtüşen hücresel otofloresansın, lekesiz yaşlanan hücrelerde biriktiği gösterilmiştir. Buna karşılık, otofloresan DDAOG'un uzak kırmızı emisyon aralığında tipik olarak ihmal edilebilirdi. Saçılma grafikleri için akış sitometresi veri toplama kurulumu, beş tepeli ticari gökkuşağı floresan kalibrasyon mikrosferleri ve lekeli hücrelerden tek kanallı floresan verileri burada gösterilmektedir.
B16-F10 melanom hücreleri için DDAOG akış sitometresi yaşlanma testi verileri, etoposid tarafından indüklenen Tedaviye Bağlı Yaşlanma veya TIS'in, canlı hücrelerin% 35'inde meydana geldiğini ve senolitik ajan ABT-263'ün TIS hücrelerini neredeyse ortadan kaldırdığını göstermiştir. A549 akciğer kanseri hücrelerinde, canlı hücrelerin% 66'sında bleomisin kaynaklı TIS ve ABT-263, yüzdeyi 15'e düşürdü. ABT-263 tek başına tedavi edilmemiş çoğalan hücreler için toksik değildi.
Bir antikor ko-boyama testinde, PE kanal verilerinin histogramı, etoposid ile tedavi edilen hücrelerin% 42'sinin yaşlanma belirteci DPPP4-pozitif için pozitif olduğunu göstermiştir. Ayrıca, iki boyutlu nokta grafikleriyle görselleştirme, etopositle muamele edilen hücrelerin% 44'ünün DDAOG ve DPP4 için yalnızca araç hücrelerinin% 4'üne karşı çift pozitif olduğunu göstermiştir. Daha sonra DDAOG boyalı hücrelerin fiksasyonu değerlendirildi.
Sabit olmayan kontrol örnekleriyle karşılaştırıldığında, sabit örnekler, BLM'yle tedavi edilen hücrelerde yaşlanan hücrelerin daha yüksek bir yüzdesi ile tedavi edilmemiş hücrelerde biraz daha yüksek bir arka plan sergilemiştir. Bu etki, gece boyunca ve bir hafta boyunca dört santigrat derecede depolanan sabit örneklerde de gözlendi. Akım sitometrisi ile zenginleştirilmiş yaşlanan hücre popülasyonlarının morfoloji ve proliferasyon belirteçleri ile sıralanması ve doğrulanması gösterilmiştir.
Sıralanmış yaşlanan hücreler, beklendiği gibi, aktinin floresan faloidin ile boyanmasıyla görselleştirilen genişlemiş morfoloji sergiledi. İmmünofloresan boyama ile proliferasyon belirteci Ki67 için sinyalde bir azalma da gözlendi. Son olarak, kemoterapi ilaçları ile tedavi edilen tümörlerde yaşlanmanın nicelleştirilmesi değerlendirildi.
Dokularda X-gal boyama nispeten zayıftı, ancak mavi boyama, doksorubisin veya pegile lipozomal doksorubisin ile tedavi edilen tümörlerde, özellikle DDAO-galaktosid akış testi ile yaşlanma için pozitif puan alan tümörlerde belirgindi. Beklendiği gibi, sadece salin içeren tümörler ihmal edilebilir yaşlanma sergiledi. Burada, herhangi bir canlı hücre analizinde olduğu gibi, protokol adımları verimli bir şekilde, ancak nazikçe gerçekleştirilmelidir.
Uzun süreli boyama prosedürlerinden veya belirtilen sürelerin ötesinde inkübasyonlardan kaçınılmalıdır. Yaşlanan hücreler sitometrik olarak sıralanırsa, immünotahliller için kültüre geri yerleştirilebilir veya lize edilebilir ve transkriptomikler veya proteomikler de dahil olmak üzere omik analiz için işlenebilir. Bu teknik, laboratuarımızın ve diğerlerinin, DNA hasarının miktarı, protein ekspresyonu ve metabolizmadaki değişiklikler de dahil olmak üzere yaşlanan tümör hücrelerinin yeni özelliklerini tanımlamasını sağlamıştır.
