Bu yöntem, gastrointestinal sistemde mikroorganizmalar tarafından kolonizasyon ve enfeksiyon dinamikleri hakkında mikrobiyoloji alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajları, insanlarda gıda kaynaklı enfeksiyonların daha fazla temsil ilerler ve oral gavaj ile karşılaştırıldığında balıkpotansiyel doku hasarı azaltır. Yıkama adımları paramecia son derece hareketli doğası nedeniyle gerçekleştirmek zor olabilir gibi bu yöntemin görsel gösteri önemlidir.
Canlı büyüyen bir kültürden, bir mililitre paramesyum kültürü ve bir mililitre e-coli MG1655 kültürünü, sekiz mililitre E3 ortamı içeren on mililitrelik doku kültürü şişesine ekleyin. Hafifçe 22 santigrat derece de taze E3 orta dokuz mililitre içeren yeni bir on mililitre doku kültürü şişesi içine co-kültür bir mililitre passaging koymadan önce şişe girdap, e-coli MG1655 mililitre başına 108 koloni oluşturan birimleri ile takviye, her iki haftada bir. Bir paramesyum içinde bakteriyel yarı ömrü belirlemek için 600 paramecia bakteri co-kültür optik yoğunluğundan paramecia sayısını saymak ve yeni bir 1.5 mililitre mikrocentrifuge tüp için yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp için supernatant bir 50 mikrolitre aliquot eklemek altı saat boyunca.
Tüplere PBS'de yüzde bir iyonik olmayan yüzey aktif maddenin 950 mikrolitresini ekleyin. Ve her örnekteki parameciayı bir dakikalık girdapla ayırın, sonra steril PBS'deki her numunenin on seyreltiminden birini yapın. Ve her seyreltmenin 100 mikrolitresini seçici plakalara 37 derecede 16 saatlik bir kuluçka için.
Ertesi gün, plaka üzerinde bakteri kolonilerinin sayısını belirlemek için sadece izole ve farklı bireysel koloniler saymak. Ve 30-300 koloni oluşturan üniteler veren seyreltme ile bir plaka tanımlayın. Enfeksiyondan bir gün önce, santrifüj ile tedavi başına 600 kültür optik yoğunluğundan bir bakteri hacmi toplamak.
Ve tüp başına bir mililitre E3 orta peletleri yeniden askıya alın. Sonra, her bakteriyel süspansiyon için uygun bir bakteriyel leke bir mikrolitre ekleyin. Ve tüpleri folyo ile fotoğraf beyazlatma koruyun.
Bakteri örneklerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca uçüstü rotasyonla kuluçkaya yatırmadan önce. Kuluçka sonunda, fazla boya kaldırmak için E3 orta büyük bir hacimde iki kez bakteri yıkayın. Ve tüp başına taze E3 orta bir mililitre pelet yeniden askıya.
Daha sonra, oda sıcaklığında iki saatlik kuluçka için her koşul başına taze paramecia iki şişe her biri için bakteriyel süspansiyon bir mililitre ekleyin. Her iki şişenin içindekileri tek tek 50 mililitrelik konik tüplere çekin. Ve santrifüj ile örnekleri pelet.
Steriolojik bir pipet kullanarak, her tüpte yaklaşık on mililitre E3 süpernatantını, santrifüj le 3 yıkama için on mililitre taze E3 orta ile değiştirin. Son yıkamadan sonra, yaklaşık on mililitre E3 süpernatantını çıkarın, peletleri bozmamaya özen tinleyip, e3 ortamının kalan on mililitresinde peletleri yeniden askıya alın. Her süspansiyonun 500 mikrolitresini tek tek 1,5 mililitrelik mikrocenrifuge tüplere aktarın ve parameyayı santrifüj le pelethaline getirin.
Süpernatantların 400 mikrolitresini atın ve geri kalan 100 mikrolitre paramecia'ya yüzde 36,5 formaldehit çözeltisi 20 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, mililitre başına ölü paramecia sayısını saymadan önce her tüpteki gerçek toplam hacmi pipetle ölçün. Zebra balığının gıda kaynaklı enfeksiyonu için, paramecia örneklerini e3 orta konsantrasyonunun mililitresi başına beş paramecia'dan iki katına kadar seyreltin.
Ve her paramecia kültürünün 3 mililitre ekleyin bir iyi bir 6 iyi plaka durum başına. Daha sonra, her kuyuya en az miktarda sıvı içinde on anestezizebra balığı aktarın. Ve co-kültürleri gün ışığı koşullarında diurnal bir kuluçka makinesinde 30 derecede iki saat kuluçkaya yatırın.
Avlanma oranını belirlemek için, beslenen zebra balığını stereo mikroskop altında görüntüleyin ve av yakalamanın video görüntülerini elde edin. Av yakalama avı doğru bir zebra balığı çarpıcı ile karakterizedir. Her saldırının bir av yakalama olayı olduğu tahmin ediliyor.
Kuluçka sonunda, zebra balıklarını 3 mililitre taze E3 orta sını içeren 5 farklı kuyuda yıkayın ve her kuyuda litre başına 100 miligram triain. Ve her zebra balığının yüzde 1'inin mililitresini siyah kuyulu altı kuyu plakası halinde gömme. Tüm balıklar gömülü olduğunda, plakayı stereo mikroskobun altına yerleştirin ve kafaların solda ve kuyrukların her görüntüleme alanında sağda olduğundan emin olmak için kırpılmış jel yükleme ucu kullanın.
Ayarlamak için agarose için 5 dakika bekleyin, sonra taze E3 orta tricaine ile takviye ile gömülü balık bindirme, ve bakteriyel enfeksiyonların ilerlemesini değerlendirmek için bir floresan mikroskop üzerinde zebra balığı görüntü. Patojenik e-coli için, ilk bakteri yoğunluğu paramesyum başına 790 bakteridir ve bakteriler her paramesyum kesilmiş atomun vakuolleri içinde yaklaşık 2,3 saatlik bir yarı ömür ile bozulur. Avlama karakteristik bir çarpıcı davranış eşlik ediyor ve yırtıcı oranının belirlenmesi varsayımı her grev 1 paramesyum içselleştirilmesine yol açar dayanmaktadır.
Sindirim sonrası, serbest bakteriler önbağırsaktan orta ve arka bağırsaklara doğru hareket ederler ve burada avlanmanın başlamasından yaklaşık 1 ila 2 saat sonra tespit edilirler. Örneğin S-enterica, nötrofillerin epiteliçine sızmasına yol açan bazı epitelyal invazyonlarla öncelikle bağırsak mukozasında lokalize olur. Belirli bakteri türleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman takmagibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
