Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии о динамике колонизации и инфекции микроорганизмами в желудочно-кишечном тракте. Основными преимуществами этого метода является то, что он является более репрезентативным пищевых инфекций в организме человека и что он уменьшает потенциальные повреждения тканей у рыб по сравнению с устные gavage. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как мытье шаги могут быть трудно выполнить из-за очень пестрый характер парамеции.
Из живой растущей культуры добавьте один миллилитр культуры парамеция и один миллилитр культуры электронной палочки MG1655 в десятимильной ткани культуры колбы, содержащей восемь миллилитров E3 среды. Слегка закружить колбу, прежде чем поместить его на 22 градусов по Цельсию проходит один миллилитр совместной культуры в новые десять миллилитров ткани культуры колбу, содержащую девять миллилитров свежих E3 среды, дополненный 108 колонии формирования единиц на миллилитр электронной палочки MG1655, каждые две недели. Чтобы определить бактериальный полуинсия в парамеции рассчитывать количество парамеции от оптической плотности 600 бактерий парамеции совместно культуры и добавить 50 микролитр aliquot супернатанта к новой 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки каждый час в течение шести часов.
Добавьте 950 микролитров одного процента неионных сурфактантов в PBS в трубки. И вынизывают парамецию в каждом образце с одной минутой вихря, а затем сделать один из десяти разбавления каждого образца в стерильных PBS. И пластины 100 микролитров каждого разбавления на селективные пластины в течение 16 часов инкубации при 37 градусов по Цельсию.
На следующий день, рассчитывать только изолированные и различные отдельные колонии, чтобы определить количество бактериальных колоний на пластине. И определить пластину с разбавлением, которое дает 30-300 колоний-образующих единиц. За день до заражения, собирать один объем бактерий из оптической плотности 600 культуры на лечение центрифугации.
И повторно приостановить гранулы в один миллилитр E3 среды на трубку. Далее добавьте один микролитер соответствующего бактериального пятна к каждой бактериальной суспензии. И защитить трубки фото отбеливания с фольгой.
Перед инкубацией образцов бактерий с окончанием вращения в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть бактерии два раза в большом объеме E3 среды, чтобы удалить избыток красителя. И повторно приостановить гранулы в один миллилитр свежей E3 среды на трубку.
Затем добавьте один миллилитр бактериальной суспензии к каждой из двух колб свежей парамеции на состояние в течение двух часов инкубации при комнатной температуре. Потяните содержимое обеих колб в состоянии в отдельные 50 миллилитров конических труб. И гранулировать образцы центрифугой.
Используя стерилогическую пипетку, замените примерно десять миллилитров супернатанта E3 в каждой трубке десятью миллилитров свежей среды E3 для 3 омывает центрифугированием. После последней стирки удалите около десяти миллилитров супернатантов E3, заботясь о том, чтобы не нарушить гранулы, и повторно приостанавливайте гранулы в оставшихся десяти миллилитров E3 среды. Передача 500 микролитров каждой подвески в отдельные 1,5 миллилитр микроценрифуги труб и гранулы парамеции центрифугации.
Отбросьте 400 микролитров супернатантов и добавьте 20 микролитров 36,5-процентного раствора формальдегида к оставшимся 100 микролитерам парамеции с нежной пипетки. После пяти минут при комнатной температуре, измерить фактический общий объем в каждой трубке по пипетке, прежде чем считать количество мертвых парамеции на миллилитр. Для пищевой инфекции зебры, разбавить образцы парамеции в два раза десять до пяти парамеции на миллилитр средней концентрации E3.
И добавить 3 миллилитров каждой культуры парамеции к одному колодец из 6 хорошо пластины в состоянии. Затем перенесите десять обезболиированных зебры в каждую колодец в минимальном объеме жидкости. И инкубировать со-культуры в течение двух часов при 30 градусах по Цельсию в дневном инкубаторе в условиях дневного света.
Чтобы определить скорость добычи, просмотрите кормление зебры под стерео микроскопом, приобретая видеозапись захвата добычи. Захват добычи характеризуется ударом зебры к добыче. Каждый удар оценивается как одно событие захвата добычи.
В конце инкубации, мыть зебры в 5 различных скважин, содержащих 3 миллилитров свежей E3 среды дополняется 100 миллиграммов на литр трикаина на скважину. И вставлять каждый зебры в 3 миллилитров 1 процент низкорастух агарозы в черный welled шесть пластины хорошо. Когда все рыбы были встроены, поместите пластину под стерео микроскопом и использовать обрезанный гель загрузки отзыв, чтобы убедиться, что головы находятся слева и хвосты находятся справа в каждом поле просмотра.
Подождите 5 минут для агарозы установить, а затем наложить встроенные рыбы со свежим E3 среды дополняется трикаин, и изображение зебры на флуоресцентный микроскоп для оценки прогресса бактериальных инфекций. Для патогенной электронной палочки, начальная бактериальная плотность составляет 790 бактерий на парамеция, и бактерии деградируют в вакуолах каждого атома парамеция с половиной жизни около 2,3 часа. Добыча сопровождается характерным поразительным поведением, а определение скорости добычи основано на предположении, что каждый удар приводит к интернализации 1 парамеция.
После переваривания, свободные бактерии перемещаются от foregut к середине и задней кишки, где они обнаруживаются примерно через 1 до 2 часов после начала охоты. S-enterica, например, локализуется в основном в кишечных слизистых оболочках с некоторым эпителиальным вторжением, ведущим к проникновению нейтрофилов в эпителий. Не забывайте, что работа с определенными типами бактерий может быть чрезвычайно опасным, и что меры предосторожности, такие как ношение надлежащего средства индивидуальной защиты всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
