Yazarlar ekipman embriyo gelişimi ve kullanımı hızlandırmak konusunda tavsiye için mikroenjeksiyon eğitim, Clarissa Henry Dr Carol Kim laboratuar teşekkür ve fli1 katkıda bulunmak için Nathan Lawson olurdu: EGFP balık. Biz yazının eleştirel okuma için Wheeler laboratuar ve Shawn Duvarlar üyelerine teşekkür ediyorum. Biz de bu proje üzerinde teknik danışmanlık için balık bakımı ve tavsiye için Mark Nilan, ve Ryan Phennicie ve Kristin Gabor teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma K. Kardeşler, bir MAFES Hatch hibe E08913-08, ve R. Wheeler bir NIH NCRR ödülü P20RR016463 bir MAFES araştırma görevliliği tarafından finanse edildi.

Tüm zebrabalıkları bakım protokolleri ve deneyler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) protokolü A2009-11-01 altında yapıldı. 1. Morfolino ve Larva Enjeksiyon Yemekleri Deney süresi: * (10-15 dakika) Zorluk derecesi: * <ol><li> Yumurta enjeksiyonlar için steril su ve mikrodalga% 2 agaroz solüsyon hazırlanır. Bunun yarısını kadar çözüm ekstra bir derin Petri (Fisher Scientific) içine bazı dökün soğuduğunda. Buz ve plaka düzeyde olduğundan emin olun serin. </li><li> Çanak soğuduktan sonra,% 2&#39;lik agaroz bir 15 mL üst tabaka dökülür. Bir sprey şişesinden steril su ile plastik kalıp (Adaptif Bilim Araçları) yivli bir yumurta enjeksiyon püskürtün. Sıcak agaroz içine kalıp oluk tarafı dikkatlice aşağı yerleştirin. Agaroz soğuduğunda, aga gelen kalıp ayırmak için (VWR Bilimsel) bir metal düz spatula kullanınyükseldi. Yavaşça agaroz gelen ızgara çıkarın. Wrap embriyo enjeksiyon parafilm yılında yemekleri (VWR Bilimsel) ve mağaza 4 ° C de ters </li><li> Balık larva enjeksiyonlar için, olarak tarif% 2 agaroz solüsyon hazırlanır. Standart bir boyut Petri (VWR Bilimsel) içine çözüm dökün ve katılaşır kadar kenara koyun. Parafilm ve mağaza içine al larva enjeksiyon yemekleri 4 ° C de ters </li></ol> 2. Mantar Kültür Hazırlık Deney süresi: ** (30 dakika) Zorluk derecesi: ** <ol><li> 10 g / L maya ekstraktı, 20 g / L pepton, 20 g / L dekstroz ve ve otoklav içine 20 g / L agar: özü-pepton-dekstroz (YPD) agar maya hazırlayın. YPD sıvı 121 10 g / L maya ekstraktı, 20 g / L pepton, 20 g / L dekstroz ve otoklav 20-30 dakika ° C hazırlamak için </li><li> Balık enfeksiyonları önce iki gün donmuş bir Sürme hazırlamakYPD agara Candida albicans kültürlerin stokları tek koloniler elde etmek. </li><li> 37 ° C&#39;da gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 16 x 150 mm kültür tüpleri (VWR Bilimsel) içine 5 ml YPD suyu koyun. </li><li> Balık enfeksiyonları önceki gün bir ahşap takoz (VWR Scientific) ile YPD agar 1 küçük koloni seçin. YPD sıvı içerisinde tekrar askıya koloni etrafında kültür tüp ve girdabında sopa koyun. </li><li> Bir 14 inç test tüpüne tekerlek (New Brunswick Scientific) ile donatılmış bir TC-7 Doku Kültürü bandajlar 37 ° C&#39;de gece boyunca büyür. </li><li> Ertesi gün, bir 1.7 ml tüp (Axygen) 1 dakika 14000x g de kültür 1 mL aşağı doğru döndürün. Süpernatantı ve vorteks (VWR Bilimsel) tarafından rezidüel sıvı pelletini. </li><li> Salin (VWR Bilimsel) Buffered 1 ml 1x Fosfat ekleyin ve daha önce açıklandığı gibi dönerler. </li><li> PBS yıkama 3 kez tekrarlayın. </li><li> 1x PBS içinde 1:100 (990 uL 1x P içine yıkanmış C. albicans 10 uL sulandırınızBS). </li><li> Bir hemositometre (VWR Bilimsel) güvenin. </li><li> 10 7 hücre / ml ye tamamlanır. </li></ol> 3. Zebra balığı Enfeksiyonlar Deney süresi: **** (1-3 saat) Zorluk derecesi: **** <ol><li> Bölüm 5 ve yumurta-su deposu, steril deiyonize su içinde 60 mg / L anında okyanus tuzları (Fisher Scientific) göre embriyolar toplayın. </li><li> Böyle Olympus SZ61 (Olympus), enfeksiyon günü dechorionate embriyolar gibi bir mikroskop kullanma. Cips bir çanta açarak, ya da hafifçe koryon içine kapalı konumda cımbız karıştırmak ve daha sonra yavaş yavaş onları açık gibi koryon 27 ayrı parçalara çektiğimi Dumont Dumoxel cımbız (VWR Bilimsel) kullanın. Balık koryon dışarı doğru pop gerekir. </li><li> Kapak çanak ortasına balık taşımak için üzerine olan girdap ekstra derin Petri. Çanağı kapağı balık aktarın. Yumurta-su çıkarın vetaze ortam ile değiştirin. Medya balıkları ekleyin. </li><li> 28 yaşında bir kuluçka sıcak larva enjeksiyon yemekleri ° C Tricaine metan sülfonat (Batı Kimya A.Ş.) 200 mg / balık anestezi için mL seyreltme hazırlayın. </li><li> Enfeksiyonu (20-50 balık) için larva istenilen sayısını sayın. Tricaine sülfonat çözüm balık koyun ve hareketli durdurana kadar 1-2 dakika bekleyin. </li><li> MPPI-3 enjeksiyon ünitesi (Uygulamalı Bilimsel Cihazlar) açın. Basınç anahtarı &quot;darbe&quot; üzerine ve &quot;darbe süresi&quot; backpressure birim için 3 PSI ile 9 ayarlanmış olduğundan emin olun. Enjeksiyon ünitesi üzerindeki basıncı 30 PSI okuyana dek azot tankına valfini açın. </li><li> 1x10 7 hücre / mL &#39;lik bir konsantrasyonda santrifüja Candida albicans 5 uL sahip bir çekilmiş mikropipet 28 yerleştirin. Mikropipet tutucu (Uygulamalı Bilimsel Cihazlar) içinde mikropipet yerleştirin. Su ile boş bir ekstra derin Petri doldurun. Ucu kadar mikropipet taşıyın igörünüm içinde sadece çekti pipet ucundan 3mm hakkında iğne takılması için mikroskop ve kullanımı Dumont Dumoxel cımbız (VWR Bilimsel) diseksiyon ile su yüzeyine dokunmadan. </li><li> Iğne kırpılmış oldu doğrulamak için ayak anahtarı (Uygulamalı Bilimsel Cihazlar) basın. Eğer başarılı olsaydı sıvı dağıtmak görmelisiniz. Sıvı bolus çapı prim 25 zebrafish larva pupil (0.21 mm, 4.9 hacim NL bir küre ye kadar) çapından daha büyük olmalıdır. Sıvı bolus çok büyük veya çok küçük buna göre eğer basıncını ayarlayın. </li><li> Tricaine metan sülfonat da balık (200 ug / mL) uyuşturmak. Bir kez balık hareketli, girdap balık merkezinde kadar kapağı ile çanak durduruldu. Bir transfer pipeti (Fisher Scientific) kullanılarak 50 balık toplayın. Ucu doğru balık yerleşmek için pipet yan dokunun. Yavaşça mümkün olduğu kadar az bir sıvı olarak kullanarak larva agaroz tabağa balık Pipeti. </li><li> Düzgün bir cam çubuk (onları ezmek için dikkatli olun!) Ile Hat balık. Çanağı mümkün kapalı olduğu kadar sıvı aspire. Herhangi nemi fitil için bir KimWipe kullanın. </li><li> Aynı zamanda balık ve iğne iyi bir görünüm elde edene kadar mikroskop altında balık larva agaroz çanak yerleştirin. Balık doğru cam iğne taşıyın. Eğer balık doğru iğne konumlandırmak olarak balık ve iğne hem Yakınlaştır. Dikkatle ilk balık kulak vezikül 27, 29 (kulak) içine cam iğne taşıyın. Eğer balığa iğne taşıdığınız bir kez ayak anahtarı (Uygulamalı Bilimsel Cihazlar) bastığınızda, arka beyin ventrikül hafifçe yukarı kaldırın çünkü bileceksiniz. </li><li> Ayak pedalı (Uygulamalı Bilimsel Aletler) basın ve sıvı balığın arka beyin ventrikül 27 içinde dispers izleyebilirsiniz. Balık ve hareket sonraki balığa iğne geri çekin. Eğer plaka üzerinde balık her enjekte kadar işlemi tekrarlayın. Herhangi bir d çıkarınEAD balık ve (50 balık) numarasının doğru tutmak yerine enjekte edin. 50 balık her bir grup için yeni bir mikroenjeksiyon iğne hazırlanması gerekmektedir enjekte veya C. albicans iğne alt yerleşir ve takunya, ya da enjekte konsantrasyonu atar. </li><li> Çanak olta balıkçılığı ve 60 mL yumurta-su içeren temiz bir ekstra derin Petri kabına balık üzerine yumurta-su püskürterek yemeğin balık yıkayın. Bu daha uzun 15-20 dakika agaroz üzerinde balık bırakmamaya önemlidir ya da dışarı kurur ve ölür. </li><li> Bitirene kadar tüm enjeksiyon işlemi tekrarlayın. PBS ve patojen olmayan enjekte kontrolleri ihmal etmeyin. </li><li> Bittiğinde, 28 balık tutmak ° C </li><li> Azot tankı vanasını kapatın. Tank hattı basıncı rahatlatmak için &quot;sürekli&quot; için &quot;darbe&quot; den enjeksiyon ünitesi anahtarı taşımak, basınç bu noktada sıfıra düşmesi gerekir. &quot;Darbe&quot; geri enjeksiyon ünitesi açın. Enjeksiyon ünitesi kapatın ve çalışma alanı temizlemek. </li></ol&gt; 4. Görüntüleme için Balık hazırlanması Deney süresi: ** (30 dakika) Zorluk derecesi: ** <ol><li> (200 ug / mL) daha önce olduğu gibi tricaine metan sülfonat çözeltisi hazırlayın. Enfekte balıkların dışarı alın ve tricaine içine aktarabilirsiniz. </li><li> Yumurta-su 47.9 mL% 0.4 düşük erime agaroz (VWR bilimsel) hazırlayın. Microwaving tarafından çözüm ısıtın. 37 ° C ve serin bir karışımına ilave tricaine metan sülfonat (200 ug / mL) </li><li> Bir kez balık tricaine metan sülfonat,% 0.4 düşük erime agaroz (VWR Bilimsel) içeren Petri (VWR bilimsel) pipetlenir bireysel balık immobilize edilir. </li><li> Sonra, görüntüleme için bir cam alt çanak (MatTek Corp Corporation) bireysel kuyulara düşük erime agaroz gelen balık taşıyın. Balık tabağın tabanına düz yatıyor yüzden mümkün olduğunca az düşük erime agaroz olarak kullanın. Sadece doldurmak için yeterli tricaine-agaroz kullanımıCam alt çanağı ner çevreler. </li></ol> 5.. Protokoller Vallahi İlgili Değişiklikler Mikroenjeksiyon için mikropipetler Deney süresi: * (10-15 dakika) Zorluk derecesi: * <ol><li> Yuan ve ark göre Flaming Brown Mikropipet Çektirme Model P-97 (Sutter Araçlar). 30 ile içi boş cam çubuklar BF120-69-10 (Sutter Instruments) çekin. Aşağıdaki koşullar Isı = 470, Hız = 120, Zaman = 200 ile program # 7 seçin. Çıkan iğne kez yaklaşık 10 mikron çapındaki ucu yukarıda 3 mm&#39;den az kırpılır 8 konik uca mm vardır. </li><li> Parantez içine bir cam mikropipet yükleyin. &quot;Çekin.&quot; I seçin Isıtma filament programı parametreleri ve cam çubuk iki çekilir mikropipetler içine ayıracaktır göre iğne ısıtır. Bir pipet saklama kutusu (Sutt Mağaza mikropipetlerer araçlar). </li></ol> Embriyo Koleksiyonu, morfolino Enjeksiyon ve Bakım Deney süresi: *** (1-2 saat) Zorluk derecesi: *** <ol start="3"><li> Rosen ve diğ. 31 yöntemlere göre embriyosu Collect. Yumurtlama tankı (Sucul Habitatlar) yumurta toplamak için bir plastik elek (Knutsford Gereçleri) kullanın. Ekstra derin petri üzerinde baş aşağı tutun elek ve yumurta toplamak için tankı su ile durulayın. </li><li> Morfolino hazırlanması için, morfolino 300 nanomol (GeneTools, LLC) 300 uL steril su ekleyin. Bu 1.0 mM çalışan bir stok verir. </li><li> Bir Nanodrop (Thermo Scientific) kullanılarak morfolino konsantrasyonu doğrulayın. &quot;Nükleik asit ve numune tipi değiştirme&quot; 265 seçmek üzere diğer &quot;ve dalgaboyu. Absorptivit bölünmesiyle 1000 tarafından morfolino moleküler ağırlığı çarparak sabiti Girişy katsayısı morfolino oligo özellik sayfasında listelenmiştir. </li><li> 2 ul 0.1 N HCI ile boş nanodrop. 0.1 N HCI (20x seyreltme) 95 uL içine morfolino çözeltinin 5 uL seyreltilir. Nanodrop kaide ve tıklama önlem seyreltme 2 uL yerleştirin. Seyreltme faktörü (20) tarafından konsantrasyonu çarpma. Bu, morfolino çalışan bir konsantrasyonda verir. Milimolar konsantrasyonu hesaplamak için morfolino moleküler ağırlığı ile elde edilen konsantrasyon böler. </li><li> Danieau tampon içinde morfolino (58 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5.0 mM HEPES, pH 7.6) ve% 0.01 fenol kırmızısı (VWR Scientific) çalışan bir stok hazırlayın. </li><li> Morfolino püskürtme çalışması için Rosen ve diğ. 31 ve Yuan ve ark. 30 göre protokolü takip. 15 dakika 28 ° C&#39;de yumurta-su ve sıcak ile morfolino enjeksiyon yemekleri durulayın. Enjeksiyon yemekleri ve line-up tek-c su kaldırmaell aşamada bir transfer pipetle enjeksiyon çanak (Bölüm 1 hazırlanan) ve oyuklara embriyoların. Her plaka yaklaşık 250 yumurta yapacak. Morfolino ile 1-2 hücreli embriyo aşamasında enjekte edilir. Yumurta 15 dakika için 27 aşamasında bir hücre içinde kalır. </li><li> Ekstra derin Petri 60 ml yumurta-su enjekte bitmiş yumurta suyu ile yumurta (60 mg / L Instant Ocean tuzları ile steril deiyonize su) ve yeri yıkayın. Morfolino enjeksiyon yemekler yeniden kullanılabilir. Bittiğinde yumurta su ile durulayın ve 4 ° C de ters mağazası </li><li> Depolama için embriyoların çanak için 60 ml yumurta-su ekleyin. 60 ml yumurta su ile ayrı ekstra derin Petri içine bir transfer pipetle 110 embriyolar sayıyoruz. 28 mikrobiyal büyüme ve inkübe embriyo önlemek için mavi 0.00003% metilen ekle ° C </li><li> Embriyo gelişimi hızlandırmak için embriyolar kafa geliştirmesine izin Kimmel ve ark. 27&#39;ye göre 24 saat ve sahne için 33 ° C&#39;de embriyo yemekleri tutmak75 gövde açısı ° (Prim 25 aşama 27). </li><li> Larva enfeksiyonu iş için C ile enjekte sonra 28 ° C&#39;de embriyo tutma albicans. </li><li> Her gün 60 ml taze yumurta suyu ile embriyo yemekleri değiştirin. </li></ol> Görüntüleme Deney süresi: ***** (1-5 saat) Zorluk derecesi: *** <ol start="14"><li> Daha önce anlatıldığı gibi cam alt görüntüleme yemekleri (MatTek Corp Corporation) olarak tricaine düşük erime agaroz (bölüm 4.2 &#39;ye göre) balık hazırlayın. Olympus IX-81 (Olympus) inverted mikroskop sahnede tabak yerleştirin. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ışık altında 4x büyütme altında odak haline balık getir. Görüntüler 4x, 20x yakalandı ve DIC, TRITC (tetrametil rodamin izotiyosiyanat) ve FITC (fluorescein izotiyosiyanat) filtre ayarları 40x büyütme. Edilebilir </li><li> Bir FV-1 ile bir Olympus IX-81 inverted mikroskop kullanın000 lazer Ariga ark göre konfokal tarama sistemi. 32. 1-1.5 mikron dilim enfeksiyon saatte Z-yığınlarının ayarlayarak 40x büyütmede zamanlı kurslar düzenlemek. </li><li> 2 saat veya daha uzun süre ders görüntüleme için, görüntüleme çanak balık her 2-3 saatte üst üste düşük erime agaroz bir katman yer. Bu kuruma ve görüntülü edilirken balık ezme gelen agaroz önler. Balık küçük bir sayı ile uzun süre dersler için, enfeksiyonlar sırasında 28 ° C korumak için (Bioptechs A.Ş.) ateşli bir sahne kullanın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Başarılı bir arka beyin ventrikül C. bir örneği 5 saat sonra enfeksiyon (hpi) ve 24 hpi bir zebrafish larva in albicans enfeksiyonu (Şekil 1) &#39;de gösterilmiştir. Yuttu C. ile makrofaj benzeri hücreler albicans 5 hpi azından arka beyin ventrikül görülür. 24 tarafından hpi, C. albicans makrofaj-benzeri hücre içindekidissemine kandidiyazis göstergesidir dorsal kuyruk dokusunda s. Bu enfeksiyon sonucu 10-15 maya-form C. doğru bir enjeksiyon üzerine oldukça bağımlıdır ardbeyin ventriküle albicans. Enfekte balıkların hemen post-enjeksiyon Eleme bunu sağlayabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4051/4051fig1.jpg" /> Şekil 1 Transgenik fli1:. EGFP 22, CaF2-yCherry Candida albicans ve konfokal mikroskopi ile intravitally yansıması ile enfekte 33 larva. (AC) 5 saat sonrası enfeksiyon enfeksiyon sitesi (arka beyin ventrikül) Ölçek çubuğu = 100 um az makrofaj benzeri hücreler EGFP-ifade ile (A) Enfekte larvanın. Aynı balık (B ve C) Yüksek büyütmeli görüntü, C. gösteren fagositler içinde albicans. Ölçek çubuğu = B için 100 mikron ve C. (DF) CaF2-yCherry C. ile dissemine kandidiyazis ile 24 saat sonrası enfeksiyon (D) Enfekte larvalar için 10 mikron EGFP mac içinde albicansdorsal kuyruk dokusunda rophage benzeri hücreler. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Aynı balık (E ve F) Yüksek büyütmeli görüntü, C. gösteren kuyruk dokusunda albicans. Ölçek çubuğu = 100 mikron.

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan zebrabalıkları mikroenjeksiyon yöntemi Gutzman ark farklıdır. 34 burada biz 36-48 hpf larvaların arka beyin ventrikül içine otik vezikül ile enjeksiyon göstermektedir. Bizim tarif ettiğimiz yöntem düşük doku hasarı ile arka beyin ventrikül içine 10-15 maya tutarlı enjeksiyon için izin verir. Bu protokol 24 hpi (Şekil 1) ve önemli öldürücülüğü / morbidite 5 sonuçları ile vücuda yayılır bir başlangıçta lokal enfeksiyon üre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Yumurtlama tankları </td><td> Sucul habitatlar </td><td> 2L </td><td></td></tr><tr><td> 1,7 mL tüpler </td><td> Axygen </td><td> MCT-175-C </td><td></td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Fisher Scientific </td><td> S17957C </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra derin Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11Z </td><td></td></tr><tr><td> Standart Petri </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 25384-302 </td><td></td></tr><tr><td> Transferi pipetler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> Maya Ekstraktı </td><td> VWR scientific </td><td> 90000-726 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 90000-264 </td><td></td></tr><tr><td> Dekstroz </td><td> Fisher Scientific </td><td> D16-1 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 90000-760 </td><td></td></tr><tr><td> Tek hemositometre </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 82030-468 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat Tamponlu Salin </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 12001-986 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Dumoxel Cımbızlar </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 100501-806 </td><td></td></tr><tr><td> Ahşap Dübeller </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 10805-018 </td><td></td></tr><tr><td> KimWipes </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 300053-964 </td><td></td></tr><tr><td> Melt DüşükAgaroz </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 12001-722 </td><td></td></tr><tr><td> Enjeksiyon yemekleri için Agaroz </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 12002-102 </td><td></td></tr><tr><td> Brown Mikropipet Çektirme Flaming </td><td> Sutter Aletleri </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Çukur cam çubuklar </td><td> Sutter Aletleri </td><td> BF120-69-10 </td><td> Bunsen beki üzerinde ısıtılarak cam çubuklar için düz cam </td></tr><tr><td> Pipet Saklama Kutusu </td><td> Sutter Aletleri </td><td> BX10 </td><td></td></tr><tr><td> MPPI-3 Enjeksiyon sistemi </td><td> Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon </td><td> MPPI-3 </td><td></td></tr><tr><td> Geri Basınç Ünitesi </td><td> Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon </td><td> BPU </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet Tutucu kiti </td><td> Staed Bilimsel Enstrümantasyon </td><td> MPIP </td><td></td></tr><tr><td> Ayak Anahtarı </td><td> Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon </td><td> FSW </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipülatör </td><td> Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon </td><td> MM33 </td><td></td></tr><tr><td> Manyetik Base </td><td> Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon </td><td> Manyetik Base </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine metan sülfonat </td><td> Batı Kimya A.Ş. </td><td> MS-222 </td><td></td></tr><tr><td> Kapsam Kesme </td><td> Olympus </td><td> SZ61 üst SZX-ILLB2-100 baz </td><td></td></tr><tr><td> Konfokal Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> FV-1000 lazer tarama konfokal sistemi ile IX-81 </td><td></td></tr><tr><td> 14 inç test tüpü tekerleği ile TC-7 Doku Kültürü Merdane davul </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> TC-7 </td><td></td></tr><tr><td> Görüntüleme Yemekleri </td><td> MatTek Corp Şirketi </td><td> P24G-1.0-10-F </td><td></td></tr><tr><td> Iğneleri yükleme için pipet uçları </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td><td></td></tr><tr><td> Plaka boşaltma ızgaralar </td><td> Adaptif Bilim Araçları </td><td> TU-1 </td><td></td></tr><tr><td> Isıtmalı Sahne </td><td> Bioptechs A.Ş. </td><td> Delta T-5 </td><td></td></tr><tr><td> Düz Spatula </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 82027-486 </td><td></td></tr><tr><td> Plastik Elekler </td><td> Knutsford Online Gereçleri </td><td> 12 cm </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 14216-184 </td><td></td></tr><tr><td> 16 x 150 mm kültür tüplerinin </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 60825-435 </td><td></td></tr><tr><td> Nanodrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol Red </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 97062-478 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> VWR Bilimsel </td><td> 87003-216 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR Bilimsel </td><td> BDH4534-500GP </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> VWR Bilimsel </td><td> BDH4532-500GP </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> VWR Bilimsel </td><td> BDH0246-500GP </td><td></td></tr><tr><td> Ca (NO 3) 2 </td><td> VWR Bilimsel </td><td> BDH0226-500GP </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> VWR Bilimsel </td><td> BDH4520-500GP </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Morpholinos </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive imaging of disseminated candidiasis in zebrafish larvae

Patojen Candida albicans neden olduğu yaygın kandidiyazis yatan bireylerde klinik olarak önemli bir sorundur ve bir% 30-40 ölüm atfedilebilen 6 ile ilişkilidir. Sistemik kandidiyazis normalde doğal bağışıklığın tarafından denetlenir ve bu tür fagosit NADPH oksidaz gibi doğuştan gelen bağışıklık hücre bileşenleri genetik bozuklukların bireylerin kandidemi 7-9 daha duyarlıdırlar edilir. Çok az C. dinamikleri hakkında bilinmektedir in vivo olarak doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile albicans etkileşim. in vitro çalışmalar Kapsamlı kurduk ana C. dışında albicans, makrofajlar içinde filizlenir ve hızlı bir şekilde nötrofil 10-14 tarafından yok edilir. In vitro çalışmalar, faydalı olsa da, sitokin düzeyleri, hücre dışı matriks ekleri ve hücreler arası iletişim 10 zamana bağlı dinamiklerini içeren in vivo ortamda, karmaşık özetlemek olamaz 15-18 </sup&gt;. -Konak etkileşimi bu faktörlerin katkısını araştırmak için, canlı bir sağlam ev sahibi olarak non-invaziv enfeksiyon bu yönleri görselleştirmek için bir model organizma bulmak için önemlidir. Zebra balığı larva enfeksiyon çalışma için benzersiz ve çok yönlü bir omurgalı sunar. Gelişim zebrabalıkları larvaların ilk 30 gün için sadece doğuştan gelen bağışıklık sistemi 2, 19-21 gibi doğal bağışıklığın çok bağımlı dissemine kandidiyazis gibi hastalıkların çalışma basitleştirilmesi, var. Zebra balığı larva küçük boyutu ve şeffaflığı hem de ev sahibi ve patojen için hücresel düzeyde enfeksiyon dinamiklerinin görüntüleme sağlar. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri floresanlama ile Transgenik larvalarının enfeksiyon 22-24 dahil belirli hücrelere türlerini tanımlamak için kullanılır. Modifiye anti-sense oligonükleotidler (Morpholinos) gibi fagosit NADPH oksidaz gibi çeşitli bağışıklık bileşenleri yıkmak ve funga yanıt değişiklikleri incelemek için kullanılabilirl enfeksiyonu 5. Küçük bir düşük omurgalı kullanılarak etik ve pratik bir avantaj ek olarak, resim her iki zebrafish larvaları intravitally ve renk açısından patojen ve ev sahibi arasındaki eğimli mücadele etmek eşsiz olasılığını sunar. Zebra balığı, insan patojen bakterilerin bir dizi model enfeksiyon için kullanılır olmuştur ve mikobakteriyel enfeksiyonu 3, 25 anlayışımızda önemli gelişmeler etkili olmuştur. Bununla birlikte, sadece son larvası 5 gibi enfekte etmekte kullanıldığında edilmiş mantarlar, 23, 26 gibi daha büyük patojenler sahiptir ve enfeksiyona yöntem ayrıntılı bir açıklaması görsel olmamıştır güncel. Burada daha önceki protokollere bizim değişiklikler dahil olmak üzere prim 25 zebrabalıkları ve arka beyin ventrikül mikroenjeksiyon için, teknikler sunuyoruz. Mantar enfeksiyonu için larva zebrabalıkları modeli kullanarak Bulgularımız in vitro çalışmalar uzaklaşacak ve konak-patojen Intera incelemek gerekli kılmaktadıryerine Petri tabağı 5 basitleştirilmiş sistem daha konağın kompleksi ortamda ction.

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları vardır<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Burada fungal patojen kullanarak Zebra balığı larvası bulaştırdıkları teknikleri göstermek<em&gt; Candida albicans</em&gt; Mikroenjeksiyon tarafından, metodoloji son zamanlarda mantar dimorfizm kontrolü fagosit NADPH oksidaz aktivitesi bulaştırmak için kullanılan<sup&gt; 5</sup&gt;.

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

non-invasive-imaging-of-disseminated-candidiasis-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.6K Görüntüleme.  University of Maine. Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları vardır 1-4. Burada fungal patojen kullanarak Zebra balığı larvası bulaştırdıkları teknikleri göstermek Candida albicans Mikroenjeksiyon tarafından, metodoloji son zamanlarda mantar dimorfizm kontrolü fagosit NADPH oksidaz aktivitesi bulaştırmak için kullanılan 5.

Video: Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Non-invaziv Endotrakeal Entübasyon Erişkin Sıçanlarda Komple Timektomi

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Non-invaziv<emIn vivo</em&gt; Aktive Edilebilir Floresan Görüntüleme Ajanını Kullanan İnflamatuvar MMP Aktivitesinin Flüoresan Optik Görüntülemesi

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Conjunktiva&#39;dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...