Agrobacterium aracılı dönüşüm genetiği değiştirilmiş patates bitkileri üretmek için kolay bir yöntemdir. Belirli gen fonksiyonlarını ve organ fizyolojisine katkılarını anlamak için. Agrobacterium rhizogenes tarafından dönüşüm hızla gen işleyen kökleri değerlendirmek için sağlam bir araçtır, benzer sonuçlar agrobacterium tumefaciens dönüşüm elde edilebilir gibi.
Bu prosedürü gösteren Sandra Fernandez-Pinan, bir post-doc, ve Jennifer Lopez, bizim laboratuvarbir maste5r öğrencisi olacaktır. Maya özü suyu beş mililitre gecede tek bir agrobacterium koloni sülb, ya da YEB orta, 28 santigrat derecede 50 mililitre centrifuge tüp antibiyotik ile desteklenen, dakikada 200 rotasyonlar büyüyerek başlayın. A-tumefaciens dönüşümü için, ertesi sabah optik yoğunluğunu ölçün.
600 nanometre veya OD 600 optik yoğunluğu 0,6'ya bir ulaştığında, agrobacterium kültürünün bir mililitresantrifüj ve antibiyotik olmadan taze YEB orta bir mililitre pelet resuspend. İkinci yıkamadan sonra, antibiyotik olmadan taze YEB ortamda pelet resuspend, 0.8 son bir OD 600 elde etmek için uygun konsantrasyon, ve buz üzerinde bakteri hücreleri yerleştirin. A.rhizogenes kullanarak bitki dönüşümü için, bir donör bitkisini 2MS orta kültürden 120'ye 120 milimetre kare plakaya dikkatlice aktarın ve mümkün olduğunca farklı kök internodlarına A.rhyzogenes kültüründen üç mikrolitre enjekte etmek için cerrahi bir iğne kullanın.
Sonra hemen katı MS orta içeren yeni bir kare plaka için tüm bitki aktarın, 0.1 milimolar acetosyringone ile takviye. Aynı plaka üzerine ikinci bir bitki yerleştirdikten sonra, aynı şekilde dönüştürülmüş, cerrahi bant ile plaka mühür ve dört gün boyunca bir büyüme kabini içinde dikey plaka yerleştirin. A.rhizogenes öldürmek ve dört gün boyunca bir büyüme kabine içinde dikey olarak mühürlü plaka yerleştirmek için sefotaksim sodyum ile takviye MS orta ile bir kare plaka bitki aktarın.
10 ila 12 gün sonra, yeni kıllı kökler ortaya çıkar. Dönüşümleri floresan stereo mikroskop la doğrulanabilir. Şu anda, her bitkinin yerli kökleri çıkarmak ve MS orta ile yeni bir kare plaka için bitkiler transfer, A.rhizogenes öldürmek için sefotaksim sodyum ile takviye.
Kompozit bir bitki elde etmek için, transgenik kıllı kökleri MS orta başka bir üç ila dört hafta boyunca büyümeye izin, sefotaksim sodyum ile desteklenmektedir. A.tumefaciens kullanarak bitki dönüşümü için. Kesip bir petri kabına üç ila dört haftalık bir bitkiden bir yaprak yerleştirin ve yaprağın parçalarını kesmeden yaprağın merkezinden kenarlara doğru bir ila üç enine kesik yapmak için neşter kullanın.
ve petiole dışlamak için. Hemen taze 2MS sıvı orta 10 mililitre içeren bir petri kabına yaprak yerleştirin, abaxial tarafı kadar, ve plaka kapağı. A.tumefaciens kültürünün 80 mikrolitresini sıvı ortama hızla ekleyin ve bakteriyel çözeltiyi homojen bir şekilde dağıtmak için ortayı bir dakika hafifçe karıştırın.
Daha sonra dikkatlice mühür ve 24 derece santigrat odasında iki günlük kuluçka için alüminyum folyo ile plaka kapağı. Dönüşüm döneminin sonunda, yaprakları abaxial-side yukarı, duygusuz-indükleyici orta, büyüme kabinebir haftalık kuluçka için cımbız ile kazınmış transfer. Kuluçka sonunda, yaprakları aktarın, abaxial tarafı yukarı, cızırtılı ateş indükleyici orta üzerine, ve bir büyüme kabine yaprakları kuluçka.
Ortaya çıkan oluklar yaklaşık iki santimetre boyunda olduğunda, her duyarsız dan üç yükselen oluk kesti. Köklenmeye izin vermek için sefotaksim sodyum ile desteklenen MG ortamı içeren mg içeren beş farklı oluk dönüşüm olayını bireysel kültür şişelerine yerleştirin ve oluklar güçlü olana kadar büyüme kabininde üç ila dört haftalık bir kuluçka için alt kümeyi uygun olarak etiketle. Kuluçka sonunda, her olayın en güçlü bitki seçin ve her bitkiden üç ila dört internodes ile oluk apikal segmentleri kesti.
Cefotaksim sodyum ile desteklenen 2MS orta içeren bir kültür şişesi içine segmentleri yerleştirin ve güçlü oluklar ve kökleri geliştirmek kadar bitkiler büyümek. Bir beta-glukuronidaz veya GUS histokimyasal muhabir gen testi gerçekleştirmek için, buz üzerinde 20 dakika boyunca% 90 soğutulmuş aseton ile iki ila üç haftalık in-vitro bitki kültürü kökleri düzeltmek. Fiksasyon sonunda, distile suda iki kez kökleri yıkayın ve 20 dakika vakum altında taze GUS boyama çözeltisi ile kökleri tedavi.
Vakum tedavisinin sonunda, yaklaşık dört saat boyunca karanlıkta 37 derece santigrat kökleri yerleştirin. Mavi bir renk görünür olduğunda, kökleri %70 etanolle iki kez yıkayın ve parlak bir alan mikroskobu altında boyamayı görselleştirin. Dönüştürülmüş tüylü kökler yeşil ışıkla aydınlatıldığında kırmızı bir floresan sergilerken, negatif kontrol dönüştürülmemiş agrobacterium böyle bir floresan göstermez ve transgenik kıllı kökleri tanımlamak için DS kırmızı dönüşüm belirtecinin uygunluğunu gösterir.
Burada A.tumefaciens ile elde edilen transgenik bitkilerin köklerinde GUS boyama ve A.rhizogenes ile elde edilen transgenik tüylü kökler gösterilmiştir. Görüldüğü gibi, kökleri A ile dönüştürülmüş, tumefaciens ve in-vitro büyüdü, endodermis mavi boyama göstermek, korteks ve stel arasında bir hücre tabakası. Daha gelişmiş köklerde, mavi etiketleme dış tabakada yamalı, eksodermis karşılık gelen.
A.rhizogenes tarafından elde edilen ve hidroponik olarak yetiştirilen dönüştürülmüş tüylü köklerde GUS belirteci özellikle yaralı bölgelerde ve ekodermiste lateral köklerin ortaya çıkmasında endodermis içinde yer alır. Hızlı bir yöntem olmasının yanı sıra, agrobacterium rhizogenes ile elde edilen transgenik kökler de kök indükleyen plazmid dna taşıdı, hangi bazı doğrudan kontrollü süreçleri deregüle olabilir. Agrobacterium rhizogenes ile elde edilen transgenik tüylü kökler çekim sırasında muhafaza edilebilir, ancak alternatif olarak büyük transit üretim için in-vitro yayılan kadar yerinde olabilir.
Patates dönüşümü gen fonksiyonu ve organizatör aktivasyon kontrol etmek için iyi bir araç sağlar, ve aynı zamanda yüksek tarımsal ilgi bir tür metodolojik kurallar üretmek için. Genetiği değiştirilmiş organizma, çevresel kirlenmeyi önlemek için kullanımdan sonra güvenli bir şekilde atılmalıdır. Ayrıca, gaz çözeltisi toksik siyanür türevi içerir, bu nedenle koruma yıpratın ve güvenli bir şekilde çözelti atın.
