Die agrobacterium-vermittelte Transformation ist eine einfache Methode zur Herstellung gentechnisch veränderter Kartoffelpflanzen. Um bestimmte Genfunktionen und ihren Beitrag zur Organphysiologie zu verstehen. Die Transformation durch Agrobacterium rhizogenes ist ein robustes Werkzeug zur schnellen Beurteilung der Genfunktionswurzeln, da ähnliche Ergebnisse durch Agrobacterium tumefaciens Transformation erzielt werden können.
Demonstriert wird dieses Verfahren von Sandra Fernandez-Pinan, einer Post-Doc, und Jennifer Lopez, einer Studentin von maste5r aus unserem Labor. Beginnen Sie mit dem Anbau einer einzigen Agrobacterium-Kolonie über Nacht in fünf Milliliter Hefe-Extrakt-Brühe, oder YEB-Medium, ergänzt mit Antibiotika in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr bei 28 Grad Celsius, bei 200 Rotationen pro Minute. Für die A-tumefaciens-Transformation, messen Sie die optische Dichte am nächsten Morgen.
Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 0,6 bis eins erreicht, zentrifugieren Sie einen Milliliter der Agrobacterium-Kultur und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischem YEB-Medium ohne Antibiotika wieder auf. Nach der zweiten Wäsche das Pellet in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika auf die entsprechende Konzentration aussetzen, um eine endgültige OD 600 von 0,8 zu erhalten, und die Bakterienzellen auf Eis legen. Für die Pflanzentransformation mit A.rhizogenes, übertragen Sie sorgfältig eine Spenderpflanze von einer 2MS-Mittelkultur auf eine 120 mal 120 Millimeter quadratische Platte und verwenden Sie eine chirurgische Nadel, um drei Mikroliter aus einer A.rhyzogenes-Kultur in verschiedene Stamminternodien wie möglich zu injizieren.
Dann die gesamte Pflanze sofort auf eine neue quadratische Platte mit festem MS-Medium übertragen, ergänzt durch 0,1 Millimolar Acetosyringon. Nachdem Sie eine zweite Pflanze auf dieselbe Platte platziert haben, die auf die gleiche Weise umgewandelt wurde, versiegeln Sie die Platte mit chirurgischem Klebeband und legen Sie die Platte vier Tage lang vertikal in einen Wachstumsschrank. Übertragen Sie die Pflanze auf eine quadratische Platte mit MS-Medium mit Cefotaxim-Natrium ergänzt, um die A.rhizogenes zu töten und legen Sie die versiegelte Platte vertikal in einem Wachstumsschrank für vier Tage.
Nach 10 bis 12 Tagen erscheinen neue haarige Wurzeln. Ihre Transformation kann durch fluoreszierendes Stereomikroskop bestätigt werden. Zu diesem Zeitpunkt verbrauchen Sie die einheimischen Wurzeln jeder Pflanze, und übertragen Sie die Pflanzen auf eine neue quadratische Platte mit MS-Medium, ergänzt mit Cefotaxim-Natrium, um die A.rhizogenes zu töten.
Um eine Verbundpflanze zu erhalten, lassen Sie die transgenen haarigen Wurzeln für weitere drei bis vier Wochen im MS-Medium wachsen, ergänzt mit Cefotaxim-Natrium. Für die Pflanzentransformation mit A.tumefaciens. Schneiden und legen Sie ein Blatt von einer drei bis vier Wochen alten Pflanze in einer Petrischale, und verwenden Sie ein Skalpell, um ein bis drei Querschnitte von der Mitte des Blattes zu den Rändern zu machen, ohne die Stücke vom Blatt zu schneiden.
und die Petiole auszuschließen. Legen Sie das Blatt sofort in eine Petrischale mit 10 Milliliterfrischem 2MS flüssigem Medium, abaxialer Seite nach oben, und bedecken Sie die Platte. 80 Mikroliter der A.tumefaciens-Kultur schnell in das flüssige Medium geben und das Medium eine Minute lang vorsichtig umrühren, um die bakterielle Lösung homogen zu verteilen.
Dann die Platte sorgfältig versiegeln und mit Aluminiumfolie bedecken, um eine zweitägige Inkubation in einer 24-Grad-Celsius-Kammer zu erhalten. Am Ende der Transformationsphase die Blätter abaxial-seite nach oben übertragen, auf das kalden-induzierende Medium, mit Einer Pinzette für eine einwöchige Inkubation im Wachstumskabinett abgekratzt. Am Ende der Inkubation die Blätter, abaxial-Seite nach oben, auf eine Tweezerzerzerinduzierendes Medium übertragen und die Blätter in einem Wachstumsschrank bebrüten.
Wenn die entstandenen Rutschen etwa zwei Zentimeter hoch sind, schneiden Sie aus jedem Callous drei auftauchende Rutschen. Legen Sie bis zu fünf verschiedene Rutsche Transformation Ereignisse in einzelne Kulturkolben mit MG-Medium mit Cefotaxim-Natrium ergänzt, um Verwurzelung zu ermöglichen, und beschriften Sie die Teilmenge als geeignet für eine drei bis vier Wochen Inkubation im Wachstumsschrank, bis die Rutschen kräftig sind. Wählen Sie am Ende der Inkubation die kräftigste Pflanze jedes Ereignisses aus und schneiden Sie die apikalen Segmente der Rutsche mit drei bis vier Internoden aus jeder Pflanze.
Legen Sie die Segmente in einen Kulturkolben mit 2MS Medium, ergänzt mit Cefotaxim-Natrium und wachsen Sie die Pflanzen, bis sie kräftige Rutschen und Wurzeln entwickeln. Um einen Beta-Glucuronidase- oder GUS-Histochemikalien-Reporter-Gentest durchzuführen, fixieren Sie die Wurzeln aus einer zwei- bis dreiwöchigen In-vitro-Pflanzenkultur mit 90% gekühltem Aceton für 20 Minuten auf Eis. Am Ende der Fixierung die Wurzeln zweimal in destilliertem Wasser waschen und die Wurzeln 20 Minuten lang mit frischer GUS-Färbelösung unter Vakuum behandeln.
Am Ende der Vakuumbehandlung die Wurzeln bei 37 Grad Celsius für etwa vier Stunden im Dunkeln stellen. Wenn eine blaue Farbe sichtbar ist, waschen Sie die Wurzeln zweimal mit 70% Ethanol und visualisieren Sie die Färbung unter einem hellen Feldmikroskop. Transformierte haarige Wurzeln zeigen einen roten Blütenstand, wenn sie mit grünem Licht beleuchtet werden, während negative Kontrolle untransformierte agrobacterium zeigen keine solche Blütenstand, was die Eignung der DS roten Transformation Marker für die Identifizierung transgene behaarte Wurzeln.
Hierbei werden GUS-Färbungen in Wurzeln transgener Pflanzen, die durch A.tumefaciens und transgene behaarte Wurzeln von A.rhizogenes erhalten wurden, gezeigt. Wie beobachtet, zeigen Wurzeln, die mit A, Tumefaciens transformiert und in-vitro angebaut werden, blaue Färbung in der Endodermis, einer Zellschicht zwischen Kortex und Stele. Bei weiter entwickelten Wurzeln ist die blaue Beschriftung in der äußeren Schicht fleckig, entsprechend der Exodermis.
Bei transformierten haarigen Wurzeln, die von A.rhizogenes erhalten und in Hydroponik angebaut werden, befindet sich der GUS-Marker speziell innerhalb der Endodermis in der Entstehung von Lateralwurzeln in den verwundeten Bereichen und in der Exodermis. Die mit Agrobacterium rhizogenes erhaltenen transgenen Wurzeln waren nicht nur eine schnelle Methode, sondern trugen auch die DNA aus dem wurzelinduzierenden Plasmid, das einige direkt kontrollierte Prozesse deregulieren kann. Die transgenen haarigen Wurzeln, die mit Agrobacterium-Rhizogenen gewonnen werden, können während des Schießens erhalten werden, können aber alternativ vor Ort sein, bis sie in-vitro für eine massive Transitproduktion vermehrt werden.
Die Kartoffelumwandlung ist ein gutes Werkzeug, um die Genfunktion und die Promotoraktivierung zu überprüfen und auch methodische Regeln bei einer Art von hohem agronomischem Interesse zu produzieren. Der genetisch veränderte Organismus sollte nach Gebrauch sicher entsorgt werden, um eine Umweltkontamination zu vermeiden. Außerdem enthält die Gaslösung giftige Zyanidderivate, so dass Sie schutzsicher sind und die Lösung sicher entsorgen.
