Преобразование при посредничестве агробактерий является простым методом производства генетически модифицированных картофельных растений. Для того, чтобы понять конкретные функции генов и их вклад в физиологию органов. Трансформация с помощью агробактерий ризогенов является надежным инструментом для быстрой оценки генов функционирования корней, так как аналогичные результаты могут быть получены путем преобразования агробактерий tumefaciens.
Демонстрация этой процедуры будет Сандра Фернандес-Пинан, пост-док, и Дженнифер Лопес, студент maste5r из нашей лаборатории. Начните с выращивания одной колонии агробактерий на ночь в пяти миллилитров дрожжевого экстракта бульона, или YEB среды, дополняется антибиотиками в 50 миллилитров центрифуги трубки при 28 градусов по Цельсию, на 200 вращений в минуту. Для преобразования a-tumefaciens, измерьте оптическую плотность на следующее утро.
Когда оптическая плотность на 600 нанометров, или OD 600 достигает 0,6 к одному, центрифуга один миллилитр культуры агробактерий и повторно гранулы в один миллилитр свежей среды YEB без антибиотиков. После второй стирки, повторно гранулы в свежем yeB среде без антибиотиков, к соответствующей концентрации, чтобы получить окончательный OD 600 из 0,8, и место бактериальных клеток на льду. Для преобразования растений с использованием A.rhizogenes, тщательно перенести донорского растения из 2MS средней культуры на 120 на 120 миллиметров квадратной пластины, и использовать хирургическую иглу, чтобы придать три микролитера из культуры A.rhyzogenes различных стволовых интернодов, как это возможно.
Затем немедленно перенесите все растение на новую квадратную пластину, содержащую твердую среду MS, дополненную 0,1 миллимоляром ацетосиренгона. После размещения второго растения на той же пластине, преобразованной таким же образом, запечатать пластину хирургической лентой, и поместить пластину вертикально внутри шкафа роста в течение четырех дней. Перенесите растение на квадратную тарелку со средой MS, дополненной цефотаксимом натрия, чтобы убить A.rhizogenes и поместите запечатанную пластину вертикально внутри шкафа роста в течение четырех дней.
Через 10-12 дней появятся новые волосатые корни. Их трансформация может быть подтверждена флуоресцентным стерео микроскопом. В это время, акциз родных корней каждого растения, и передать растения на новую квадратную пластину с MS среды, дополненной цефотаксим натрия, чтобы убить A.rhizogenes.
Чтобы получить композитное растение, пусть трансгенные волосатые корни растут еще три-четыре недели в среде MS, дополненный цефотаксимом натрия. Для преобразования растений с использованием A.tumefaciens. Вырезать и поместить лист от трех до четырех недель завод в чашку Петри, и использовать скальпель, чтобы сделать один-три поперечных сокращений от центра листа до краев, не разрезая куски от листа.
и исключить петиол. Немедленно поместите лист в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров свежей жидкой среды 2MS, абаксиарной стороной вверх, и накройте тарелку. Быстро добавьте 80 микролитров культуры A.tumefaciens в жидкую среду и аккуратно перемешайте среду в течение одной минуты, чтобы однородно распределить бактериальный раствор.
Затем аккуратно запечатать и накрыть пластину алюминиевой фольгой для двухдневной инкубации в 24-градусной камере Цельсия. В конце периода трансформации, передача листьев abaxial-стороне вверх, к безымянной индуцирующей среде, Царапины с пинцетом в течение одной недели инкубации в кабинете роста. В конце инкубации, передача листьев, abaxial стороне вверх, на пинцет-Царапины стрелять вызывая средний, и инкубировать листья в рост шкафа.
Когда возникающие желоба около двух сантиметров в высоту, вырезать три возникающих желобов от каждого callous. Поместите до пяти различных событий преобразования желоба в отдельные культуры колбы, содержащие MG среды дополняется цефотаксим натрия, чтобы укоренения, и этикетки подмножество, как это уместно в течение трех-четырех недель инкубации в кабинете роста, пока желоба энергичны. В конце инкубации выберите самое энергичное растение каждого события и вырежьте апические сегменты желоба тремя-четырьмя межродами с каждого растения.
Поместите сегменты в культурную колбу, содержащую 2MS-среду, дополненную цефотаксимом натрия, и выращивайте растения до тех пор, пока у них не разовьются энергичные желоба и корни. Для выполнения бета-глюкуронидазы или GUS гистохимического анализа генов репортера, исправить корни от двух до трех недель в пробирке растительной культуры с 90%охлажденный ацетон в течение 20 минут на льду. В конце фиксации, мыть корни два раза в дистиллированной воде и лечить корни со свежим РАСТВОРом ГУС-окрашивания под вакуумом в течение 20 минут.
В конце вакуумной обработки, поместите корни при 37 градусов по Цельсию в темноте в течение четырех часов. Когда синий цвет виден, мыть корни два раза с 70%этанола, и визуализировать окрашивание под ярким микроскопом поля. Преобразованные волосатые корни обладают красной флуоресцентностью при освещении зеленым светом, в то время как отрицательный контроль нетрансформированных агробактерий не демонстрируют такой флуоресценции, что указывает на пригодность маркера преобразования DS red для выявления трансгенных волосатых корней.
Здесь показано окрашивание GUS в корнях трансгенных растений, полученных A.tumefaciens, и трансгенных волосатых корней, полученных A.rhizogenes. Как отмечается, корни, преобразованные с A, tumefaciens и выращенные в пробирке, демонстрируют синее окрашивание в эндодермии, клеточном слое между корой и стелой. В более развитых корнях синяя маркировка неоднородная во внешнем слое, соответствующая экзодермису.
В преобразованных волосатых корнях, полученных A.rhizogenes и выращенных в гидропонике, маркер GUS специально расположен в эндодермисе при появлении бокового корня в раненых областях и в экзодермии. Помимо быстрого метода, трансгенные корни, полученные с помощью ризогенов агробактерия, также несли ДНК из корневой плазмидной плазмиды, которая может дерегулировать некоторые непосредственно контролируемые процессы. Трансгенные волосатые корни, полученные с agrobacterium rhizogenes могут быть сохранены во время съемки, но в качестве альтернативы могут быть на месте до распространения в пробирке для массового транзитного производства.
Преобразование картофеля является хорошим инструментом для проверки функции гена и активации промоутера, а также для получения методологических правил у вида с высоким агрономическим интересом. Генетически модифицированный организм следует безопасно выбросить после использования, чтобы избежать загрязнения окружающей среды. Кроме того, газовый раствор содержит токсичные производные цианида, так что износ защиты и отказаться от раствора безопасно.
