アグロバクテリウム媒介性の形質転換は、遺伝子組み換えジャガイモ植物を作り出す簡単な方法である。特定の遺伝子機能と臓器生理学への貢献を理解するために。アグロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換は、遺伝子機能根を迅速に評価するための堅牢なツールであり、同様の結果がアグロバクテリウム・トゥメファシエンによる形質転換によって得られる。
この手順をデモンストレーションするには、ポストドクターのサンドラ・フェルナンデス=ピナンと、私たちの研究室のmaste5rの学生であるジェニファー・ロペスです。1回のアグロバクテリウムコロニーを5ミリリットルの酵母エキススープ(YEB培地)で一晩で成長させることから始め、50ミリリットルの遠心分離管で抗生物質を28°C、毎分200回転で補う。タメファシエンス変換の場合は、翌朝の光学密度を測定します。
600ナノメートルで光学密度、またはOD600が0.6対1に達すると、遠心分離1ミリリットルの農業用細菌培養液培養液を抗生物質なしで1ミリリットルの新鮮なYEB培地で再懸濁する。2回目の洗浄後、抗生物質を使わずに新鮮なYEB培地中のペレットを再懸濁し、適切な濃度にして0.8の最終OD600を得、細菌細胞を氷の上に置く。A.rhizogenesを用いた植物の形質転換のために、ドナー植物を2MS培地培養から120×120ミリメートル平方プレートに慎重に移し、外科用針を用いて、A.rhyzogenes培養物から異なる茎間節に3マイクロリットルを注入する。
その後、すぐに0.1ミリモルアセトシリンギロンを補充固体MS培地を含む新しい正方形のプレートに植物全体を転送します。同じプレートに第2の植物を配置した後、同じ方法で変換し、外科用テープでプレートを密封し、4日間成長キャビネットの中にプレートを垂直に置きます。植物をセフォタキシムナトリウムを添加した正方形のプレートに移し、A.rhizogenesを殺し、密封されたプレートを成長キャビネットの中に垂直に4日間置きます。
10~12日後、新しい毛深い根が現れます。それらの変換は、蛍光ステレオ顕微鏡によって確認することができる。このとき、各植物の天然根を切除し、植物をMS培地で新しい正方形プレートに移し、セフォタキシムナトリウムを添加してA.rhizogenesを殺す。
複合植物を得るために、トランスジェニック毛状根をMS培地でさらに3〜4週間成長させ、セフォタキシムナトリウムを添加する。A.tumefaciensを使用した植物の変換のため。生後3~4週間の植物の葉をシャーレに切って置き、メスを使って葉の中央から端まで1~3回横切りします。
そしてペチオールを除外する。すぐに新鮮な2MS液体媒体の10ミリリットルを含むシャーレに葉を置き、腹立ち側を上に、プレートを覆います。A.tumefaciens培養液を80マイクロリットル素早く液体培地に加え、1分間穏やかに攪拌して細菌溶液を均質に分配します。
その後、慎重にシールし、24度の摂氏室で2日間のインキュベーションのためのアルミニウム箔でプレートをカバー。変態期間の終わりに、葉を腹軸側に移し、無神経誘導媒体に、成長キャビネット内で1週間のインキュベーションのためにピンセットで削った。インキュベーションの終わりに、葉を移し、腹軸側を上に、ツイーザー掻き取りシュート誘導媒体に、成長キャビネットに葉をインキュベートする。
出現したシュートが約2センチメートルの高さである場合、各無神経から3つの新興シュートをカットします。発根を可能にするためにセフォタキシムナトリウムを添加したMG培地を含む個々の培養フラスコに最大5つの異なるシュート変換イベントを配置し、シュートが活発になるまで成長キャビネット内の3〜4週間のインキュベーションのためにサブセットに適切なラベルを付けます。インキュベーションの最後に、各事象の最も活発な植物を選択し、各プラントから3〜4つのノード間でシュートの素端セグメントを切断します。
セフォタキシムナトリウムを添加した2MS培地を含む培養フラスコにセグメントを入れ、活発なシュートと根を発達させるまで植物を栽培します。β-グルクロニダーゼまたはGUSの化学レポーター遺伝子アッセイを実行するには、氷上で20分間、90%チルドアセトンで2〜3週間のインビトロ植物培養から根を固定します。固定の終わりに、蒸留水で根を2回洗い、20分間真空下で新鮮なGUS染色液で根を処理します。
真空処理の終わりに、約4時間暗闇の中で37°Cの根を置きます。青色が見える場合は、70%エタノールで2回根を洗い、明るいフィールド顕微鏡で染色を可視化します。形質転換された毛状根は緑色光で照らされると赤色の花色を呈し、陰性対照未形化の農細菌はこのような蛍光を示さないが、トランスジェニック毛根を同定するためのDS赤色変換マーカーの適合性を示す。
ここで、A.tumefaciensおよびA.rhizogenesにより得られたトランスジェニック毛状根によって得られたトランスジェニック植物の根におけるGUS染色が示されている。観察されるように、Aで形質転換した根、トゥメファシエンス、およびインビトロで成長し、皮質とsteleの間の細胞層である内皮における青色染色を示す。より発達した根では、青色のラベルは、エキソデルミに対応する外部層にパッチリである。
A.rhizogenesによって得られた形質転換された毛深い根において、そして水耕栽培で成長したGUSマーカーは、特に損傷した領域およびエキソデルミの内側根の出現において内皮内に位置する。迅速な方法であることに加えて、アグロバクテリウム・リゾゲネスで得られたトランスジェニック・ルーツは、根を誘発するプラスミドからDNAを運び、直接制御されたプロセスの一部を調節解除する可能性がある。アグロバクテリウム・リゾゲネスで得られたトランスジェニック毛状の根は、撮影中に維持することができますが、代わりに大規模なトランジット生産のためにインビトロに伝播されるまでオンサイトにすることができます。
ジャガイモの変換は、遺伝子機能とプロモーター活性化をチェックし、また高い農業性関心の種で方法論的ルールを生成するための良いツールを提供します。遺伝子組み換え生物は、環境汚染を避けるために使用後に安全に廃棄する必要があります。また、ガス溶液は有毒シアン化物誘導体を含むので、保護を着用し、溶液を安全に廃棄する。
