DIC mikroskopisi, karmaşık ortamlarda plazmonik nano partiküllerin görüntülenmesinde koyu alandan üstündür. Ancak DIC, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için daha fazla bilgi ve beceri gerektirir. DIC mikroskopi hem yüksek lateral çözünürlük hem de sığ alan derinliği sağlar.
Bu özelliklerin her ikisi de hücre içinde veya karmaşık ortamlarda nano tanecikleri izlerken son derece önemlidir. Başlamak için, her cam kapak lı slip'in ortasına sığ ve kısa bir çizik işareti yerleştirmek için karalama kalemi kullanın ve ardından ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi camı temizleyin. Daha sonra, orijinal depolama kabından 05 miligramlık altın nanopartikül çözeltisinin 100 mikrolitresini çıkarmak ve çözümü 1,5 mililitrelik centrifuge tüpüne çıkarmak için bir mikropipet kullanın.
6, 000 kez yerçekimi 10 dakika için örnek santrifüj. Bittiğinde, nanopartikül çözeltisindeki fazla yüzey aktif maddeden kurtulmak için bir mikropipet ile süpernatantı çıkarın. Daha sonra, santrifüj tüpüne 100 mikrolitre ultra saf su ekleyin.
Kısaca pelet kırmak için örnek girdap, ve sonra nanopartikül agregaları tamamen yeniden askıya almak için hemen sonra 20 dakika sonicate. Bir mikropipet kullanarak, temizlenmiş ve çizik cam kapak üzerine nanopartikül çözeltisi altı mikrolitre dropcast. Daha sonra kapağı dikkatlice çevirin ve ikinci bir büyük mikroskop camı parçasının üzerine yerleştirin.
Damla hızlı bir şekilde cam iki parça arasında eşit olarak yayılmalıdır. Hava kabarcıkları cam iki parça arasında sıkışıp önlemek için dikkat edin. Sıvının buharlaşmasını önlemek için kapak kapağının kenarlarını kapatmak için dar bir oje hattı kullanın.
Örneği mikroskop aşamasına yerleştirin ve mikroskobun amacını ve kondansini hizala. Üzerinde örnek bulunan odak düzlemini bulmak ve daha önce oluşturulan çizilme işaretini bulmak için odağı ayarlayın. Nano parçacıklar ortaya çıkana kadar odak üzerinde ince ayar ve odaklanın.
Kondansatörün doğru yerleşimini belirlemek için, 20x hedefiile başlayıp 80 veya 100x gibi yüksek büyütmelere hareket ederek Kohler aydınlatma yöntemini kullanın. Ardından, görüntüleme için örnek içinde ilgi çekici bir bölge seçin. Bölgeyi kameranın görüş alanına ortalayarak odağı gerektiği gibi ayarlayın.
Mikroskop de Senarmont tasarımına sahipse, polarize maksimum arka plan yok oluşuna yakın bir şekilde ayarlanmış olarak başlayın ve polarizeyi yavaş yavaş arka plan yok oluşunu azaltmaya doğru döndürün. Arka plan yoğunluğu giderek artacaktır. Nano partiküller yerel arka plan ortalamasına göre en büyük yoğunluk farklarına ulaştığında ideal ayar elde edilir.
Plazmonik nano tanecikleri için, en büyük kontrast genellikle maksimum arka plan yok oluşuna yakın nispeten karanlık bir arka planla elde edilir. Başıboş aydınlatmanın işlemle etkileşimkurmasını önlemek için oda aydınlatmasını kapatın. İlgi bölgesini görüntülemek için ana lokalize yüzey plazmon rezonans dalga boyu ile birlikte bulunan merkezi dalga boyu ile yarım maksimum bant geçiş filtresinde 10 nanometrelik tam genişlikte bir tam genişlik yerleştirin.
Ardından, arka plan seviyesi kameranın maksimum kapasite seviyesinin %5 ila %40'ına kadar lamba yoğunluğunu veya pozlama süresini ayarlayın. İlgi çeken bölgedeki hiçbir nesne, kameranın maksimum yoğunluk seviyesinin %90'ını aşan sinyal yoğunlukları sergilememelidir. Örneği, her biri 10 nanometrenin yarı maksimum tam genişliğine sahip bant geçişli filtrelerle görüntüleyin ve bir bütün olarak tüm dalga boyu ilgi aralığında görüntülemeyi etkinleştirin.
Görüntülerdeki arka plan yoğunluğunun lamba gücünü değil, pozlama süresini ayarlayarak %5 oranında kaldığından emin olun. Filtreleri değiştirdikten sonra, görüntüleri yakalamadan önce örneği yeniden odakla. İlgili tüm bilgileri korumak için görüntüleri sıkıştırılmamış TIFF dosyaları ve/veya yazılımın yerel dosya biçiminde kaydedin.
Analize başlamak için görüntüyü ImageJ ile açın. İlgi alanının ana bölgesine bir dikdörtgen çizmek için dikdörtgen aracını kullanın. Ardından araç çubuğunda görüntüyü seçin, yakınlaştırmaya gidin ve seçim ekiseçin.
Görüntüleme penceresi seçili alanı yakınlaştırır. Ardından, görüntüyü seçin, ayarlamak için gidin ve parlaklık/kontrast'ı seçin. Örnek bölgenin görünümünü iyileştirmek için görüntünün minimum, maksimum, parlaklığı ve kontrastını ayarlayın.
Bu ayarlamalar bilimsel verileri değiştirmez, sadece örnek bölgenin daha iyi görünür olmasını sağlar. Şimdi, dikdörtgen aracını tekrar kullanın ve ölçülecek ilk nanoparçacığın etrafına bir kutu çizin. Kutu, nanopartikülün havadar diskinden sadece biraz daha büyük olmalıdır.
Seçildikten sonra, çözümlemek için gidin ve ölçü'nü seçin. Seçili kutunun içinde bulunan pikseller için minimum, en büyük ve ortalama yoğunlukları bildiren yeni bir pencere görüntülenir. Kutunun özgün boyutunu koruyarak, kutuyu arka plan kontrastının nispeten eşit olduğu ve parçacık veya kirletici madde bulunmayan parçacığın hemen bitişiğindeki bir alana sürükleyin.
Arka plan alanının ortalama yoğunluğunu belirlemek için ölçü aracını yeniden kullanın. Serideki tüm görüntülerdeki her parçacık için bu işlemi tekrarlayın. Ardından, her parçacığın tüm dalga boyları ve açılar daki kontrastını veya yoğunluğunu hesaplamak için verileri bir elektronik tabloya aktarın.
Her parçacığın kontrastını hesaplamak için aşağıdaki denklemi girin. Son olarak, X ekseni boyunca dalga boyu ve Y ekseni boyunca kontrast veya yoğunluk ile veri çizerek belirli bir nanopartikül konumunda spektral profil grafiği. En uygun görüntüleme ayarını belirlemek için, bu altın nanospheres çeşitli polarize ayarları nda görüntülenmiştir.
Sıfır derecede, parçacıklar çoğunlukla beyaz görünür ve orta kısımlarında koyu bir şerit belirir. Bu nanosfer örnekleri için çapraz kutuplaşmanın göstergesidir. Polarize farklı açılara döndürüldüğünde, parçacıklar bir köşeye doğru karanlık gölgeler atarlar.
Ancak, parçacık kontrast değerleri önemli ölçüde değişir. Bu örnek için en uygun görüntüleme ayarı 10 derecepolarize bir kayma ile. Burada dalga boyu altın nanospheres kontrast karşı çizilmiştir.
Her veri noktası, her parçacık çapı için ortalama 20 nanoküreyi temsil eder. Her parçacığın en yüksek kontrastı boyutuna bağlı olarak biraz değişir. Yoğunluk ve rotasyon bu altın nanorod gibi anizotropik şekiller ile daha da önemlidir.
Burada dalga boyu iki farklı polarize ayarı yoğunluğuna göre çizilir. Her iki durumda da, parlak tarafın yoğunluğu karanlık tarafınkinden çok daha güçlüdür. Sahnenin dönüşü sırasında lokalize yüzey plazmon rezonans dalga boyunda tek bir altın nanorod yoğunluğu profili örnek 180 derece boyunca döndürülür gibi karanlık ve parlak yanları arasında büyük bir yoğunluk farkı gösterir.
Örnek görüntüleme son derece önemlidir. Bu mikroskobik adına hem çalışkanlık ve sabır gerektirir. Numunenin bir dizi gün içinde yeniden görüntülenmesi gereken bir deneme gerçekleştiriyorsanız, çizilme işaretleri gibi önemli noktalar ilgi alan bölgenizi değiştirmede kritik öneme sahip olur.
DIC mikroskobu, özellikle dinamik ve hücresel ortamlarda nano partikülleri inceleyen araştırmacıların ilgisini çekmektedir. Dic, özellikle karmaşık örnekleme ortamlarında en uygun mekansal çözünürlüğü sunduğundan.
