A microscopia DIC é superior ao campo escuro em nanopartículas plasmônicas de imagem em ambientes complexos. No entanto, a DIC também requer maior conhecimento e habilidade para obter resultados reprodutíveis. A microscopia DIC fornece alta resolução lateral e profundidade de campo rasa.
Ambos os traços são extremamente importantes no monitoramento de nanopartículas dentro das células ou em ambientes complexos. Para começar, use uma caneta de assinatura para colocar uma marca de arranhão rasa e curta no centro de cada mancha de vidro e, em seguida, limpe o vidro conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, use uma micropipette para remover 100 microlitadores de uma solução de nanopartícula de ouro de 05 miligramas por mililitro de seu recipiente de armazenamento original, e ejete a solução em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar a amostra por 10 minutos a 6.000 vezes a gravidade. Quando terminar, remova o supernatante com uma micropipette para se livrar do excesso de surfactante da solução de nanopartículas. Em seguida, adicione 100 microliters de água ultra-pura ao tubo centrífuga.
Brevemente vórtice a amostra para quebrar a pelota, e depois sonicá-la por 20 minutos imediatamente depois para resususpensar totalmente os agregados de nanopartículas. Usando uma micropipette, dropcast seis microliters de solução de nanopartículas no deslizamento de vidro limpo e arranhado. Em seguida, vire cuidadosamente a tampa e coloque-a em cima de um segundo pedaço maior de vidro microscópio.
A queda deve se espalhar rapidamente uniformemente entre os dois pedaços de vidro. Tome cuidado para evitar ficar bolhas de ar presas entre os dois pedaços de vidro. Use uma linha estreita de esmalte para selar as bordas da tampa para evitar a evaporação do líquido.
Coloque a amostra no estágio do microscópio e alinhe o objetivo e o condensador do microscópio. Ajuste o foco para encontrar o plano focal com a amostra nele e localize a marca de arranhão criada anteriormente. Concentre-se nele e ajuste o foco até que as nanopartículas entrem em vista.
Para determinar a colocação precisa do condensador, utilize o método de iluminação Kohler começando com o objetivo de 20x e, em seguida, movendo-se para altas ampliações como 80 ou 100x. Em seguida, selecione uma região de interesse dentro da amostra para imagem. Centralize a região no campo de visão da câmera e ajuste o foco conforme necessário.
Se o microscópio tiver o design de Senarmont, comece com o polarizador perto da extinção máxima do fundo e gire gradualmente o polarizador para diminuir a extinção de fundo. A intensidade de fundo aumentará gradualmente. O cenário ideal é alcançado quando as nanopartículas atingem sua maior diferença de intensidade em comparação com a média de fundo local.
Para nanopartículas plasmônicas, o maior contraste é tipicamente alcançado com um fundo relativamente escuro em ou perto da extinção máxima de fundo. Desligue a iluminação da sala para evitar que a iluminação perdida interaja com o processo. Coloque em prática um filtro de largura total de 10 nanômetros a meio máximo de largura com seu comprimento de onda central co-localizado com o comprimento de onda de plasmon de superfície localizado principal, a fim de ver a região de interesse.
Em seguida, ajuste a intensidade da lâmpada ou o tempo de exposição até que o nível de fundo esteja em 5% a 40% do nível máximo de capacidade da câmera. Nenhum objeto dentro da região de interesse deve exibir intensidades de sinal que excedam 90% do nível máximo de intensidade da câmera. Imagem a amostra com uma série de filtros de passe de banda que cada um tem uma largura total a meio máximo de 10 nanômetros, e que como um todo permitem a imagem em toda a faixa de comprimento de onda de interesse.
Certifique-se de que a intensidade de fundo nas imagens permanece dentro de 5% uma da outra, ajustando o tempo de exposição e não a potência da lâmpada. Depois de trocar filtros, refoco a amostra antes de capturar imagens. Salve as imagens como arquivos TIFF não compactados e/ou no formato de arquivo nativo do software, a fim de preservar todas as informações relevantes.
Para começar a análise, abra a imagem com ImageJ. Use a ferramenta retângulo para desenhar um retângulo ao redor da região principal de interesse. Em seguida, na barra de ferramentas, selecione imagem, vá para zoom e selecione para seleção.
A janela de imagem aumentará a área selecionada. Em seguida, selecione imagem, vá para ajustar e selecione brilho/contraste. Para melhorar a visão da região da amostra, ajuste o mínimo, máximo, brilho e contraste da imagem.
Esses ajustes não alteram os dados científicos, apenas permitem uma melhor visibilidade da região amostral. Agora, use a ferramenta retângulo novamente e desenhe uma caixa em torno da primeira nanopartícula a ser medida. A caixa deve ser apenas um pouco maior do que o disco arejado da nanopartícula.
Uma vez selecionado, vá analisar e selecione a medida. Uma nova janela aparece que relata as intensidades mínimas, máximas e médias para os pixels localizados dentro da caixa selecionada. Mantendo o tamanho original da caixa, arraste a caixa para uma área imediatamente adjacente à partícula onde o contraste de fundo é relativamente uniforme, e não há partículas ou contaminantes presentes.
Use novamente a ferramenta de medida para determinar a intensidade média da área de fundo. Repita este processo para cada partícula em todas as imagens da série. Em seguida, exporte os dados para uma planilha para calcular o contraste ou intensidade de cada partícula em todos os comprimentos de onda e ângulos.
Digite na equação a seguir para calcular o contraste de cada partícula. Finalmente, gráfico o perfil espectral em uma determinada posição de nanopartículas, plotando dados com o comprimento de onda ao longo do eixo X e o contraste ou intensidade ao longo do eixo Y. Para determinar a configuração de imagem ideal, essas nanosferas de ouro foram imagens em várias configurações polarizadoras.
A zero graus, as partículas aparecem principalmente brancas com uma faixa escura correndo através de sua seção média. Isso é um indicativo de polarização cruzada para amostras de nanosfera. Quando o polarizador é girado para diferentes ângulos, as partículas lançam sombras escuras em direção a um canto.
No entanto, os valores de contraste de partículas mudam drasticamente. Para esta amostra, a configuração de imagem ideal é com uma mudança polarizadora de 10 graus. Aqui o comprimento de onda é traçado contra o contraste das nanosferas de ouro.
Cada ponto de dados representa uma média de 20 nanosferas para cada diâmetro de partícula. O contraste de pico para cada partícula muda ligeiramente dependendo do seu tamanho. A intensidade e rotação é ainda mais importante com formas anisotrópicas como este nanorod dourado.
Aqui o comprimento de onda é plotado contra a intensidade em duas configurações polarizadoras diferentes. Em cada caso, a intensidade do lado bom é muito mais forte do que a do lado negro. O perfil de intensidade de um único nanorod de ouro em seu comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície localizada durante a rotação do palco mostra uma grande diferença de intensidade entre os lados escuro e brilhante à medida que a amostra é girada através de 180 graus.
A imagem da amostra é extremamente importante. Requer diligência e paciência por parte do microscopista. Se você está realizando um experimento que requer reimaginar a amostra durante uma série de dias, então marcos como as marcas de arranhões são fundamentais para realocar sua região de interesse.
A microscopia dic está crescendo no interesse de pesquisadores que estudam nanopartículas, especialmente em ambientes dinâmicos e celulares. Porque o DIC oferece uma resolução espacial ideal, especialmente em ambientes de amostragem complexos.
