DIC المجهرية متفوقة على حقل الظلام في التصوير جسيمات نانوية plasmonic في بيئات معقدة. ومع ذلك، يتطلب DIC أيضًا معرفة ومهارة أكبر للحصول على نتائج قابلة للتكرار. يوفر المجهر DIC دقة جانبية عالية وعمقًا ضحلًا في المجال.
كل من هذه الصفات هي في غاية الأهمية عند رصد الجسيمات النانوية داخل الخلايا أو في بيئات معقدة. للبدء، استخدم قلماً لوضع علامة خدش ضحلة وقصيرة على مركز كل غطاء زجاجي، ثم قم بتنظيف الزجاج كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك، استخدم ميكروبيبيت لإزالة 100 ميكرولترات من محلول جسيمات نانوية ذهبية من 05 ملليغرام لكل ملليلتر من حاوية التخزين الأصلية، وإخراج المحلول إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي العينة لمدة 10 دقائق في 6،000 مرة الجاذبية. عند الانتهاء، قم بإزالة المابير مع ميكروسيبيت للتخلص من السطح الزائد من محلول الجسيمات النانوية. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من المياه النقية للغاية إلى أنبوب الطرد المركزي.
لفترة وجيزة دوامة العينة لتفريق بيليه، ثم سونيكاتيد لمدة 20 دقيقة على الفور بعد ذلك لإعادة بناء المجاميع النانوية تماما. باستخدام ميكروبليت، dropcast ستة ميكرولترات من محلول الجسيمات النانوية على غطاء الزجاج النظيف والمخدش. ثم الوجه بعناية coverlip وضعه على رأس قطعة ثانية أكبر من زجاج المجهر.
وينبغي أن القطر بسرعة انتشرت بالتساوي بين قطعتين من الزجاج. الحرص على تجنب الحصول على فقاعات الهواء المحاصرين بين قطعتين من الزجاج. استخدم خطًا ضيقًا من طلاء الأظافر لغلق حواف الغطاء لمنع تبخر السائل.
ضع العينة على مرحلة المجهر، ومحاذاة الهدف والمكثف من المجهر. ضبط التركيز للعثور على الطائرة البؤرية مع العينة على ذلك وتحديد موقع علامة الصفر التي تم إنشاؤها في وقت سابق. التركيز عليه وصقل التركيز حتى جسيمات نانو تأتي في العرض.
لتحديد موضع دقيق للمكثف، استخدم طريقة إضاءة كوهلر من خلال البدء بالهدف 20x، ومن ثم الانتقال إلى التكبير عالية مثل 80 أو 100x. بعد ذلك، حدد منطقة ذات أهمية داخل العينة للتصوير. توسّط المنطقة في مجال عرض الكاميرا، ثم اضبط التركيز البؤري حسب الضرورة.
إذا كان المجهر لديه تصميم دي Senarmont، تبدأ مع مجموعة المستقطب بالقرب من الانقراض الخلفية إلى أقصى حد وتدوير تدريجيا المستقطب نحو خفض الانقراض الخلفية. كثافة الخلفية سوف تزيد تدريجيا. ويتحقق الإعداد المثالي عندما تصل الجسيمات النانوية إلى أكبر فرق كثافة مقارنة بمتوسط الخلفية المحلية.
بالنسبة للجسيمات النانوية البلازمونية ، عادة ما يتحقق أكبر تباين مع خلفية داكنة نسبيًا عند أو بالقرب من الانقراض الأقصى للخلفية. إيقاف إضاءة الغرفة لمنع الإضاءة الضالة من التفاعل مع العملية. وضع في مكان 10 نانومتر كامل العرض في نصف الحد الأقصى شريط تمرير مرشح مع الطول الموجي المركزي المشترك مع الطول الموجي الرئيسي سطح مترجمة plasmon الرنين من أجل عرض المنطقة ذات الاهتمام.
بعد ذلك، اضبط شدة المصباح أو وقت التعرض حتى يصل مستوى الخلفية إلى 5٪ إلى 40٪ من الحد الأقصى لمستوى سعة الكاميرا. لا ينبغي أن تظهر أي أجسام داخل المنطقة ذات الأهمية على كثافة الإشارة التي تتجاوز 90٪ من مستوى الشدة الأقصى للكاميرا. صورة العينة مع سلسلة من المرشحات تمرير الفرقة أن كل لديه عرض كامل في نصف الحد الأقصى من 10 نانومتر، وأنه ككل تمكين التصوير عبر نطاق الطول الموجي بأكمله من الفائدة.
تأكد من أن كثافة الخلفية في الصور تبقى في حدود 5٪ من بعضها البعض عن طريق ضبط وقت التعرض وليس قوة المصباح. بعد تبديل الفلاتر، إعادة تركيز العينة قبل التقاط الصور. حفظ الصور كملفات TIFF غير مضغوط و / أو في تنسيق الملف الأصلي للبرنامج من أجل الحفاظ على كافة المعلومات ذات الصلة.
لبدء التحليل، افتح الصورة باستخدام ImageJ. استخدام أداة المستطيل لرسم مستطيل حول المنطقة الرئيسية من الفائدة. ثم على شريط الأدوات، حدد الصورة، انتقل إلى التكبير/التصغير، وحدد التحديد.
سوف تقوم نافذة التصوير بتكبير المساحة المحددة. بعد ذلك، حدد الصورة، انتقل إلى ضبط، وحدد السطوع / التباين. لتحسين عرض منطقة العينة، قم بضبط الحد الأدنى، والحد الأقصى، والسطوع، والتباين للصورة.
ولا تغير هذه التعديلات البيانات العلمية، بل إنها تمكن فقط من تحسين رؤية منطقة العينة. الآن، استخدم أداة المستطيل مرة أخرى وارسم مربع حول أول جسيمات نانوية ليتم قياسها. يجب أن يكون الصندوق أكبر قليلاً من القرص المهواة للجسيمات النانوية.
بمجرد تحديد، انتقل إلى تحليل، وحدد قياس. يظهر إطار جديد الذي يبلغ الحد الأدنى والحد الأقصى و متوسط شدة بكسل الموجودة داخل المربع المحدد. مع الاحتفاظ بالحجم الأصلي للمربع، اسحب المربع إلى منطقة مجاورة مباشرة للجسيمات حيث يكون التباين في الخلفية متكافئاً نسبياً، ولا توجد جسيمات أو ملوثات موجودة.
استخدم أداة القياس مرة أخرى لتحديد شدة الوسط لمنطقة الخلفية. كرر هذه العملية لكل جسيم في جميع الصور في السلسلة. ثم قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات لحساب تباين أو شدة كل جسيم عبر جميع الأطوال والزوايا الموجية.
أدخل المعادلة التالية لحساب تباين كل جسيم. وأخيراً، رسم ملف تعريف طيفي في موضع جسيمات نانوية معينة عن طريق رسم البيانات مع الطول الموجي على طول المحور س والتباين أو الكثافة على طول المحور Y. لتحديد الإعداد الأمثل للتصوير، تم تصوير هذه النانوية الذهبية في عدة إعدادات المستقطب.
عند درجة الصفر، تظهر الجسيمات في الغالب بيضاء مع شريط داكن يعمل عبر القسم الوسطي. وهذا يدل على الاستقطاب المتقاطع لعينات الغلاف النانوي. عندما يتم تدوير المستقطب إلى زوايا مختلفة، ويلقي الجسيمات الظلال الداكنة نحو زاوية واحدة.
ومع ذلك، فإن قيم تباين الجسيمات تتغير بشكل كبير. لهذه العينة، يكون إعداد التصوير الأمثل مع إزاحة مستقطبة 10 درجات. هنا يتم رسم الطول الموجي ضد تباين النانويات الذهبية.
وتمثل كل نقطة بيانات ما متوسطه 20 نانوفراً لكل قطر جسيم. وتتغير ذروة التباين لكل جسيم قليلاً تبعاً لحجمها. كثافة ودوران هو أكثر أهمية مع الأشكال anisotropic مثل هذا نانورود الذهب.
هنا يتم رسم الطول الموجي ضد كثافة في اثنين من إعدادات المستقطب مختلفة. في كل حالة، كثافة الجانب المشرق أقوى بكثير من الجانب المظلم. يظهر ملف شدة نانورود ذهبي واحد في طول موجة الرنين البلازموني السطحي الموضعي خلال دوران المرحلة اختلافًا كبيرًا في الكثافة بين الجانبين الداكن والمشرق حيث يتم تدوير العينة من خلال 180 درجة.
التصوير بالعينة مهم للغاية. وهو يتطلب الاجتهاد والصبر من جانب الميكروبكوبيست. إذا كنت تقوم بإجراء تجربة تتطلب إعادة تصوير العينة على مدى سلسلة من الأيام، فإن المعالم مثل علامات الخدش تكون مهمة في نقل المنطقة التي تهمك.
DIC المجهرية يتزايد في الاهتمام من قبل الباحثين الذين يدرسون الجسيمات النانوية ، وخاصة في البيئات الديناميكية والخلوية. لأن DIC يوفر الدقة المكانية المثلى، وخاصة في بيئات أخذ العينات المعقدة.
