DREADDs nöronal aktiviteuzaktan kontrol için en popüler kemogenetik yaklaşımdır. Burada tekrarlayan veya kronik DREADD kontrolü için yeni alternatifler sunuyoruz, daha az invaziv CNO doğum yöntemleri odaklanarak. Farelerde uzun süreli CNO teslimatı için tekrarlayan göz damlaları veya hayvanın içme suyu yoluyla kronik olarak iki strateji tanımlıyoruz.
Burada açıklanan protokoller, farklı DREADD varyantları, dokular ve hatta türler de dahil olmak üzere çeşitli deneysel tasarımlara uyarlanabilen CNO teslimatı için kronik ve noninvaziv seçeneklere örneklerdir. Bir CNO teslimat için önemli bir konu bir hayvanın stres ve ağrı. Bu protokoller bu sorunu en aza indirir ve farklı deneysel ayarlara kolayca uyarlanır.
Ameliyatı gerçekleştirmeden önce stereotaksik çerçeveyi ve gerekli tüm aletleri temizleyin ve sterilize edin. Çerçeve hazır olduğunda, anestezik karışık arka plan vahşi tip erkek fare de parmak ucu çimdik yanıt eksikliği onaylamak, başın üst tıraş ve çerçeve ye fare nin başını düzeltmek. Daha sonra gözlere göz koruyucu yağlayıcı uygulayın ve son olarak, sıralı povione iyot ve% 70 etanol scrubs ile maruz kalan cilt temizleyin.
Kafatası ortaya çıkarmak ve bregma noktasına çerçeve kalibre etmek için steril bir neşter kullanın. 2.9 milimetrelik bir medialateral koordinatta sondaj ve hipokampusu hedeflemek için eksi 2.7 milimetrelik bir ön arka koordinat. Beyin maruz kaldığında, bir mikro enjektör kullanın ve tek taraflı eksi üç milimetre bir dorsal ventral derinlikte hipokampusa adenoilişkili virüsün 90 nanolitre enjekte mikrokapiller pipetler çekti.
Sonra naylon dikişile kesi kapatın ve analjezi yönetimi için çerçeve hayvan çıkarın. Tekrarlayan CNO teslimatı için, enjeksiyondan dört hafta sonra başlayarak, göz damlalarının uygulanmasından önce her fareyi günde üç ila dört gün boyunca üç ila dört dakika boyunca her fareyi scruffing yaparak hayvanları işlemeye alıştırın. Fareler işleme alıştıkğınızda, vücut ağırlığı konsantrasyonu kilogram başına CNO bir miligram elde etmek için teslim edilecek CNO uygun miktarda belirlemek için her fare tartMak.
İnaktif faz sırasında ışıklar sönmeden iki saat önce, hazırlanan CNO çözeltisinin 1-3 mikrolitresini P10 mikropipetine yükleyin ve fareyi paslandırma yoluyla etkisiz hale getirin. Pipet ucunda sabit bir damlacık oluşana kadar çözeltiyi yavaşça dışarı atın ve damlacıkları farenin gözüne pipet ucuna dokunmadan solüsyona gelene kadar dikkatlice korneaya yakın bir şekilde getirin. Sonra bir sonraki hayvanın gözüne CNO göz damlası uygulamadan önce ev kafesi için fare dönün.
CNO'nun fare etkin fazı sırasında teslim edilmesi gereken durumlarda, uygun hayvan taşıma ve CNO teslimatı için loş kırmızı Bir ışık olduğundan emin olun. Kronik CNO tedavisi için, dört hafta sonrası enjeksiyon başlayan ve tedaviye başlamadan üç gün önce, küçük şişeler kauçuk pouts ile durdu ve düzenli su 10 mililitre içeren alüminyum folyo ile kaplı ile düzenli su şişeleri değiştirin. Farelerin şişelere alışmasını sağlamak için kafeslere bantla sabitleyin.
Her fare için günlük su tüketimini ölçün ve her fareyi tartının. Minimum CNO konsantrasyonu ile maksimum etkinliği gösteren dozu belirlemek için bir dizi CNO konsantrasyonu test edin. Sonra düzenli su artı CNO gerekli miktarda sekiz mililitre ile her küçük şişe doldurun.
Sınırlı CNO tedavisi için, enjeksiyondan dört hafta sonra başlayan ve tedaviye başlamadan üç gün önce, hayvanın aktif evresinin son kısmında orijinal su şişesinden uzakta kafese 10 mililitre su artı %1 sakaroz içeren küçük bir şişe yerleştirin. Pozlama sonunda, her kafesten su artı sakaroz çözeltilerini çıkarın ve her hayvan için sakaroz su tüketimini ölçün. CNO teslimatı için, şişeleri beş mililitre su artı %1 sakaroz ve kilogram başına bir miligram CNO ile doldurun.
Şişeyi aktif fazın son kısmında şekerli su alışma döneminde aynı pozisyonda yerleştirin, şişeleri çıkararak ve tüketilen su miktarını ölçerek, sakaroz ve CNO'yu gösterdiği gibi. Deneyin sonunda, tedavi edilen hayvan beynini taze fiksatif olarak hasat edin. 9 ila 12 saat sonra, kriyoprotect beyin dokusu bir 30% sakaroz çözeltisi.
Beyin battığında, örneği kriyostat'a böl. Tüm beyin bölümleri elde edildiğinde ve nonspesifik bağlanma bloke edildiğinde, doku örneklerini bir anti-c-Fos antikor solüsyonu ile bir gecede sürekli ajitasyonla dört derece yekpiz. Ertesi sabah, numuneleri uygun bir floresan konjuge ikincil antikorile kuluçkaya yatırmadan önce numuneleri yıkama başına taze PBS'de üç beş dakikalık yıkama ile yıkayın.
Oda sıcaklığında bir saat ve ışıktan korunan sürekli ajitasyondan sonra floresan konfokal mikrokroskopi ile etiketlenmiş doku bölümlerinin dijital görüntülerini elde edin. Görüntüleri ImageJ'e yükledikten sonra, Adeno ile ilişkili enfekte mCherry pozitif hücrelerin alanlarını ölçmek ve alan başına aktif hücre sayısını elde etmek için bu bölgedeki C yanlış pozitif hücrelerin sayısını ölçmek için anahat. Göz damlası kullanılarak tekrarlayan CNO teslimi, çoğu enfekte nöronda cFOS ekspresyonunun sağlam bir indüksiyonunu ortaya çıkarır ve tekrarlayan maruziyet sırasında CNO doğumunun etkinliğinin devam ettiğini gösterir.
Ayrıca CNO tedavisinden iki saat sonra alınan örneklerde CNO maruziyetinden altı saat sonra alınan örneklere göre cfos indüksiyonunun önemli bir indüksiyonu gözlenir ve CNO tarafından indüklenen değişikliklerin zamana bağlı olduğunu gösterir. Günlük su tüketimi artı CNO tüketilen düzenli su toplam hacmi ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde farklı değildir. Benzer şekilde, gece boyunca tüketilen su miktarı artı%1 sakaroz CNO eklenmesinden etkilenmez, ne de her iki su artı CNO günlük tüketiminde farklılıklar, ve su artı sakaroz artı CNO beş günlük bir deneysel dönemde gözlenen.
CNO göz damlası uygulamasına benzer şekilde, cFos sağlam bir indüksiyon iki sonra gözlenir, ancak CNO içme suyu erişim altı saat değil. Buna ek olarak, düşük Bir CNO dozu bir tuzlu kontrol ile karşılaştırıldığında cFos aktivasyonu ortaya çıkarmaz gibi CNO için etkinlik açık bir eşik vardır, yüksek dozlarda sağlam ve benzer cFos indüksiyon neden ise. Biz önemli ölçüde nöronal aktivasyonu azaltmaz en düşük CNO dozu tanımlamak için bir doz yanıt analizi yapmanızı öneririz, ve bir ligand olarak klozapin kullanımı dikkate.
Burada nöronal aktivasyon sonucu CNO aracılı cFos indüksiyonu kullanılarak gösterilmiştir. Ancak, bu protokol kolayca elektrofizyolojik analiz veya davranış testleri için kabul edilebilir. DREADD teknolojisi nöronal aktivite uzaktan kontrol için güçlü bir araçtır, ve CNO teslimat için alternatif stratejiler tasarımı.
Deneysel ayarlar ve potansiyel klinik müdahaleler için seçenekler yelpazesini artıracağız.
