Yazarlar ölçekleme protokolleri ve veri değerli tartışma için glial-Nöronal Etkileşimleri UC Riverside Merkezi&#39;ni kabul etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, yaptıkları işin yayın sponsor Abcam&#39;dan için samimi ederiz size vermek istiyorum.

<ol>
	<li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2++elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices.">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication.">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li><li>Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+alpha-adrenergic-mediated+activation+of+cortical+astrocytes+in+vivo.">Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo.</a> Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).</li><li>Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenoceptors+in+brain:+cellular+gene+expression+and+effects+on+astrocytic+metabolism+and+Ca2.">Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2.</a> Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).</li><li>Porter, J. T., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+in+situ+respond+to+glutamate+released+from+synaptic+terminals.">Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals.</a> J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).</li><li>Bernardinelli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+display+complex+and+localized+calcium+responses+to+single-neuron+stimulation+in+the+hippocampus.">Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).</li><li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses.">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca2++signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo.">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li><li>Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+astrocyte+physiology+from+pharmacology.">Sorting out astrocyte physiology from pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling+and+Gliotransmission+in+Normal+vs+Reactive+Astrocytes.">Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes.</a> Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).</li><li>Nedergaard, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artifact+versus+reality--how+astrocytes+contribute+to+synaptic+events.">Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events.</a> Glia. 60, 1013-1023 (2012).</li><li>Nizar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+stimulus-induced+vasodilation+occurs+without+IP3+receptor+activation+and+may+precede+astrocytic+calcium+increase.">In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase.</a> J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).</li><li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis.">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li><li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing.">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li><li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates.">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li><li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2++increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity.">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li><li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity.">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo.">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo.">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li><li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity.">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li><li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells.">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li><li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics.">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li><li>Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++responses+to+thyrotropin-releasing+hormone+and+angiotensin+II:+the+role+of+plasma+membrane+integrity+and+effect+of+G11alpha+protein+overexpression+on+homologous+and+heterologous+desensitization.">Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization.</a> Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).</li><li>Shelton, M. K., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+exhibit+Ca2+-elevating+muscarinic+cholinergic+and+histaminergic+receptors+in+situ.">Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ.</a> J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).</li><li>Hermans, E., Challiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+signalling+and+regulatory+properties+of+the+group+I+metabotropic+glutamate+receptors:+prototypic+family+C+G-protein-coupled+receptors.">Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors.</a> Biochem. J. 359, 465-484 (2001).</li><li>Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Metabotropic+Glutamate+Receptors+for+the+Generation+of+Calcium+Oscillations+in+Rat+Hippocampal+Astrocytes+In+Situ.">The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ.</a> Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).</li><li>de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+agonism+at+G+protein-coupled+receptors:+(patho)physiological+relevance+and+implications+for+drug+discovery.">Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+101+induces+long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+efficacy+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Fiacco, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+stimulation+of+astrocyte+calcium+in+situ+does+not+affect+neuronal+excitatory+synaptic+activity.">Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity.</a> Neuron. 54, 611-626 (2007).</li><li>Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+plasticity+studied+using+in+vivo+hippocampal+activity-blockade:+synaptic+scaling,+intrinsic+plasticity+and+age-dependence.">Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence.</a> PLoS One. 2, (2007).</li><li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ.">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li><li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer+1+and+layer+2/3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo.">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology,+pharmacology,+and+signal+transduction.">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li><li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Ca2++detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes.">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult.">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li></ol>

Yazarlar, bu çalışmalarda kullanılmış olan tetrodoksin Abcam&#39;dan temin satın olduğunu ifşa istiyoruz. Abcam hipotezler, tasarım ya da veri toplama ile hiçbir ilgisi yoktu. Akran değerlendirme süreci tamamlandıktan sonra Abcam&#39;dan tarafından işin sponsorluğunda ilişkin tüm iletişim oluştu.

Tarif ölçeklendirme modelleri Astrositik grup mGluR&#39;lerinin uzun vadeli plastisite araştırmak için pratik yöntemleri temsil eder. Görüntüleme spontan ve uyarılmış Ca 2 + olaylar, sağlam kanıtlar astrosit Ca 2 + yükselmeler Gq GPCR&#39;dir aktivasyon 10 mansap IP 3 R-duyarlı mağazalardan salıverilmesinin ardından meydana tespit edildiği gibi, Astrositik Gq GPCR&#39;dir aktivite değişiklikleri ölçmek için hassas bir tahlil sağlar 12, 17, 18. Nüfus astrositlerin yüzdesi grup I mGluR agonisti ve bu Ca2 + tepkilerinin desen yanıt astrositler tarafından Grup I mGluR&#39;leri değişiklikleri rapor etmektedir. Ca 2 + göstergesi ile astrositler yüklemek için kullanılan özel teknik, astrositik Gq GPCR aktivitedeki değişiklikler için deney tasarımında önemli bir husustur. Bolus-yükleme veya toplu yükleme birden astrositleri, veya pBireysel astrositlerin atch klemp yükleme astrositlerde görüntü Ca 2 + geçici için kullanılabilir. Her yaklaşımın bazı avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. Doğrudan yama kelepçe ile Ca 2 + göstergeli astrositler doldurma gibi SR-101 gibi sekonder bir marker için gerek kalmadan bir astrosit olarak hücrenin açık belirlenmesini sağlar. Göstergenin Patch-kelepçe teslimat da hücreler sağlıklı dilim ve sinapsların (mevcut lazer gücüne bağlı olarak) daha sağlam etkileşimler ile potansiyel derin gür ince süreçlerin, dahil olmak üzere küçük Astrositik bölmelerden Ca 2 + aktivite kayıt sağlar. Veriler her seferinde bir hücre toplanır Ancak, patch-clamp yükleme düşük verim uğrar. Bulk-yükleme, aksine, astrositlerin, çok sayıda Ca 2 + göstergesi ile yüklenir ve aynı anda görüntülü sağlar. Ancak, astrositler yüzeye yakın dilimin (&lt;20 um) bağlı bir endişe ile yüklenirhücre sağlığı ve sağlam sinapsların hakkında s. Burada sunulan backpressureyi bolus yükleme protokolü nispeten yüksek verim ve dilim (40-75 mikron) içindeki derin Ca 2 + etkinliğini izlemek için yeteneği ile, bir orta yol sunuyor. Bolus yükleme tekniği kullanılarak kendiliğinden aktif astrositlerin yüzdesinde önemli bir artış ve nöronal sinapsların, astrositik proseslerde arasındaki bağlantı 15 daha eksiksiz olduğunu düşündürmektedir, kütle-yük ile karşılaştırıldığında görülmektedir. Iyi bir yükleme ile, sık sık 2-foton mikroskopi kullanılarak astrositler (veriler gösterilmemiştir) veya potansiyel olarak daha da küçük bölmelerin ana işlemlerinde Ca 2 + etkinliğini izlemek için. Ancak, bakım sınırları spesifik olmayan arka plan boyama içine karıştırmak gibi, belirli bir astrosit için küçük süreçleri atama icra edilmesi gerekir. Kütle-yük ya da yükleme bolus prosedürlerin kullanılması ile ek bir sorun, bir ikinci mar için ihtiyaçastrosit tanımlanması için ker. Bu, tercihen astrositler Ca 2 + göstergeleri AM ester almak birçok yıldan beri bilinmektedir olsa da, ikinci işaretleyici SR-101, genellikle astrositler olarak yüklenmiş hücreler doğrulamak için kullanılır. SR-101 kendi nöronların 29&#39;un iç heyecanlanma değiştirebilir. SR-101 kullanımı sinirsel uyarıların mümkün SR-101 etkilerini sınırlamak için ttx tüm astrocyte Ca 2 + ölçümleri gerçekleştirmek için ihtiyaç corroborates. Kontrol ve deney grubu hem de SR-101 dahil olduğu varsayılarak, tek başına markör nöronal aksiyon potansiyellerinin, uzun süreli manipülasyona aşağıdaki astrosit Ca 2 + sinyal gözlenen etkilerin hesaba olmamalıdır. O 2,5 mM K + vs arasındaki farkı azaltabilir olarak SR-101, ancak, yüksek K + deneylerde bir endişe daha fazla olabilir 5.0 mM K + bazal ateşleme hızı orantılı değilse. Ca 2 + sunmak için çok umut verici bir yaklaşım </sup&gt; Astrositlere gösterge Ca 2 + boyalar kullanarak daha geleneksel yaklaşımlara cazip bir alternatif sunduğu son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Önemli gelişmeler astrositlere 30-32 hedeflenen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GeCIS) ile son yıllarda yapılmıştır. GeCIS hipokampus gibi ilgi konusu bir beyin bölgesine adeno-ilişkili viral vektörler in vivo mikroenjeksiyon ile astrositler teslim edilebilir. GeCIS ekspresyonu viral enfeksiyon 32 takip eden yaklaşık iki hafta sonra elde edilir. Astrositlerde GeCIS kullanılmasıyla sunulan pek çok avantajı vardır. İlk olarak, vektör, bir astrosit-özgü promoteri kullanılarak astrositleri hedef, bu etiketlenmiş hücrelerin astrosit 32 vardır. İkincisi, sinyal-gürültü ama şimdi hücrede 32 bir yama pipet geçirdiğine invaziflik olmadan, boya yama kelepçe teslim kullanılarak elde edilebilir ne karşılaştırılabilir görünüyor. Üçüncü olarak, göstergeler del olabilirivered ve toplu yükleme dağıtım yöntemlerini kullanarak sorunlu yetişkin doku olarak ifade edilmiştir. Ayrıca, ifade birden astrositlere arasında ayrım yeteneği sunan mozaik olduğunu. Aynı zamanda soma ve ince branchlets kayıt Böylece, çeşitli potansiyel olarak astrositler, eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Bu nedenle, potansiyel olarak tek bir tekniği büyük ölçüde verimliliği artırarak, astrositik Gq GPCRs ölçekleme aktivitesini kaydetmek için üç ayrı teknikler (toplu yükleme, bolus-yükleme ve patch-kelepçe yükleme) yerine kullanılabilir. Astrositlere Ca 2 + göstergelerin viral aracılı teslim kullanarak bir potansiyel dezavantajı dilim sağlık 32 olası etkisidir. GeCIS sunmak için kullanılan adeno-ilişkili viral vektörler astrositlerin 33 arasında reaktif gliozis neden olduğu daha önce gösterilmiştir. Genel olarak beyin dilimleri hazırlanması muhtemel enf sürümü de dahil olmak üzere patoloji erken aşamalarında başlatırlammatory 10 molekülleri. Bu nedenle, GeCIS kullanımı viral vektörler kullanılarak teslim astrositik reseptörlerinin ölçekleme indüklemek için gerekli olan uzun inkübasyon süreleri, deney ile birlikte bu tür dilim sağlık bağlamında ek dikkate almak gerekir. Bu protokolü kullanarak, bu bir yanıt üretmek için agonist için uygulama süresi reseptör durumu bir fonksiyonu olarak değişir akılda tutmak önemlidir. Agonistin, belirli bir konsantrasyonu için, uygulama süresi reseptörleri küçültülmüş ve daha kısa olması durumunda reseptörlerin bir Ca 2 + üretmek için yeterli reseptörleri aktif hale getirmek için yeterli bir doku konsantrasyonu elde etmek üzere, ilaç için, yukarı ölçeklenmiş daha uzun olması gerekir yanıtı. Bu nedenle, ilaç uygulama süreleri ve potansiyel konsantrasyonları, ölçekleme amaçlanan yönüne bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Örneğin, agonist konsantrasyonu c düşürülebilir gerekebilirTTX ve ase yanıtları doyurarak önlemek, ve hatta bir yanıt görmek için yüksek K + dilimleri beklettikten sonra artmış. Özel olarak, DHPG konsantrasyonu 5-15 uM genellikle güvenilir yanıtları üretmek için çok düşük olduğu gibi, Ca2 + cevabı desen çalışması için 5.0 mM K + tedavi sonrası 30-50 uM TTX tedavi sonrası 5-15 uM kaymıştır grup mGluR&#39;lerinin küçültmeden sonra astrositlere. Astrosit Ca 2 + faaliyet kaydı plazma zarına veya ikinci reseptör ekleme ya da interne etme doğrudan bir kanıt sağlar. Ancak, Gq GPCR&#39;dir ifade seviyeleri ve spontan arasında doğrudan bir ilişki incelenmiş ve Ca 2 + geçişlerini 21-24, Ca 2 + değişikliklerin en mantıklı yorumunu uyarılmış vitro önceki çalışmalarından elde edilen veriler ile veri olağanüstü benzerliğe göre sinyal astrosit yüzey reseptör ekspresyon seviyeleri olmasıdırdeğiştirdi. Bir Ca 2 + aktivitesi üzerindeki etkisi mahaline hakkında ek delil sağlamak istiyorsa bir tamamlayıcı bir yaklaşım önemli bir husus olabilir. Biz kullanılan bir strateji Astrositik MrgA1R farelerin hipokampal dilimleri TTX inkübasyon etkisini araştırmaktır. Bu transgenik fareler, sadece astrositlerde yabancı Gq GPCR (MrgA1R) ifade eder. Bu reseptör beyne yerel olduğu için, aktivitesi düzeylerini değiştirmek için mevcut herhangi bir endojen nörotransmiter yoktur. Önceki çalışmalar bu reseptör aynı astrositler 34 endojen Grup I mGluR&#39;leri olarak sinyal molekülleri ile aynı hücre içi angaje önerdi. TTX in MrgA1R farelerden dilimlerinin sonra uzun süreli inkübasyon, yavru kontrole kıyasla agonist ile uyarılan MrgA1R yanıtlarında bir fark, dilimler astrosit üzerindeki etkisi Ca 2 + aktivitesi yüzey reseptörüne lokalize değişiklikler nedeniyle olduğuna dair kanıt sağlayacak kuluçkalanmıştır Özellikle grup I mGluR&#39;daki cevapları hala anlaml iseicantly aynı astrositler geliştirilmiştir. Alternatif bir, belki daha fazla yer strateji sürece bir membran fraksiyonu yüzey reseptör ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler için analiz edilebilir olarak, Western blot analizi için kesitlerden izole astrositler olacaktır bile. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) veya akım sitometri burada yararlı olabilir. Nöronların çalışma için bu tekniğin olası uygulamaları, astrositler ve astrosit-nöronal etkileşimleri çoktur. Deneylerde, sadece DHPG uyarılmış grup I astrositik Ca2 + tepkileri çocuk farelerden izole, akut hipokampal dilimlerde, mGluR çalışıldı. Bu hazırlık, sağlam afferentleri (Schaffer kollateral), ama aynı zamanda onları (CA3 piramidal hücreler) doğuran nöronlar vardır mümkün postsinaptik hücreleri (CA1 piramidal hücreleri) üzerine bu Glutamaterjik nöronların ateşleme oranlarını manipüle yapma ve sadece olan işlemler associat stratum radiatum astrositlerBu sinapsların ile e. Akut hipokampal nöronlarının dilim diğer tip ateşleme oranlarını değiştirmek için en iyi preparat olabilir, bununla birlikte, pek çok afferentler onlara yol nöronların koparılır. Bununla birlikte, diğer astrositik Gq GPCR alt tiplerinin plastisite gözlemlemek için bazı slice preparatlarda mümkün olabilir. Örneğin, dilim sağlam hipokampta bazal ön beyin kolinerjik nöronlarının ve projeksiyonları ile hazırlanabilir. TTX veya yüksek K +, bu dilimlerin Kuluçka kolinerjik giriş 1 önemli bir kısmını almak stratum Oriens&#39;in astrositlerde, içinde mAChRs&#39;sini ölçeklendirilmesidir açan, kolinerjik nöronlar bazal ateşleme oranlarını etkileyecektir. Alternatif bir ölçekleme oluşur, TTX bir salıverilme plast implantasyonu ile elde edilir bir in vivo model kullanmak olabilir bozulmamış tüm bağlantıları ile beynin belirli bir alanda astrositik reseptör ölçekleme, çalışma henüz denenmemiş bir yaklaşımic polimer Elvax 40W ilgi 35 bölge üzerindedir. Bu yaklaşım nöronal ölçekleme bir çalışmada daha önceden kullanılmış olan ama aynı zamanda Astrositik ölçekleme için geçerli olmalıdır. Son olarak, uygun okuma ile, gelecekteki çalışmalarda G ler ya da G i GPCRs değişiklikler dahil olmak üzere diğer GPCR&#39;dir aileleri, incelemek olabilir. Bir i GPCR&#39;ler lokal olarak herhangi bir dilim hazırlık içinde GABA internöronlardan projelendirme ateş engellenmesi aşağıdaki etkilenecek Astrositik GABA B G tahmin olabilir. Böyle ikinci haberci cAMP bir gerçek zamanlı gösterge olarak diğer sinyal molekülleri hedefleyen yeni göstergeler geliştirilmesi, nöron-to-astrosit reseptör iletişim araştırma tamamen yeni bir alan açmak istiyorum. Bazal nöron atış oranları manipülasyonu ile astrositik mGluR&#39;lerin Çift yönlü ölçekleme nörotransmitter AP-aracılı serbest bırakmak için astrositlerin duyarlılık bir ölçüsünü sağlar. Astrositler görünüşte kendiliğinden APleri ve glutamat hissedebiliyorumekstrasellüler K + fizyolojik bir aralıkta olsa Schaffer kollateral-CA1 piramidal hücre sinapslarında te bırakma. TTX akut uygulama kendiliğinden astrosit sıklığını astrositik reseptörleri AP dedektörleri olduğuna dair kanıtlar temin Ca 2 + aktivitesi 18, 36, 37, 36 olur ilintisiz popülasyondaki astrositler arasındaki Ca 2 + aktivitesi, azaltmaz iken. Bu astrocytes hiçbir genel Ca 2 + aktivite üzerindeki etkisi ile spontan nöronal APleri anlamda düşündürmektedir. Bu yaygın IP 3 hücre içi konsantrasyonları tespit edilebilir bir Ca2 + yükselmesi yol açmak için yeterli IP 3 Rs teşvik etmek için bir eşik seviyesine ulaşmak için ihtiyaç olduğu kabul edilmektedir. Spontan nöronal AP ölçülebilir Ca 2 + yükselmeleri üretmeden Astrositik GPCR&#39;ler aktive misiniz? Gelecek çalışmalar Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) veya benzer bir techn kullanmak olabilir<html> alıcısına G protein bağlama (reseptör aktivasyonunun bir ölçütü) ve iç depolar Ca 2 + bırakılması arasındaki ilişkinin incelenmesi için (örneğin, BRET gibi) ique. Bu teknoloji, bozulmamış doku preparasyonlarda kullanıma hazır olmadan önce bir süre olabilir, ancak BRET, G protein-to-GPCR kuplajı 38, in vitro olarak tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu Astrositik Gq GPCR&#39;ler çok daha sık mevcut Ca 2 + görüntüleme araçlarını kullanarak kaydedilebilir daha aktive ediliyor mümkündür. Aksiyon potansiyelleri algılama ek olarak, astrositik Gq GPCR&#39;ler da bir çalışmada 39 de belirtildiği gibi nörotransmiter minyatür quantal salınımını tespit etmek mümkün olabilir. Burada anlatılan iki yönlü ölçekleme yöntemi Astrositik Gq GPCR&#39;ler kuluçka protokolde bafilomisin A1 dahil ederek nörotransmiter quantal veziküler salınımını tespit ölçüde bir ölçü sağlamak için gelecekteki çalışmalarda kullanılabilir. Astrositik reseptör ölçekleme de yetişkin farelerden elde edilen doku kaynaklı olabilir eğer ntent &quot;&gt; Bugüne kadar, ölçeklendirme protokolleri sadece çocuk farelerin (p12-p18) hipokampal dilimleri kullanılmıştır. Dolayısıyla halen bilinmemektedir. bir zorlayıcı yeni bir çalışma astrositlerde grup I mGluR&#39;daki ifade çağın ilk haftadan sonra önemli ölçüde azalır ve yetişkin astrositlerde 40 reseptör ifadesi çok düşük seviyelerde, yetişkinliğe kadar azalmaya devam ediyor. Bu nedenle Astrositik mGluR&#39;ler aşağıdaki büyütmek olmadığını belirlemek için ilginç olacağını gösteriyor uzun genç farelerin astrositlerde görülen yaklaşan düzeylere yetişkin fare hipokampal dilimleri nöronal ateşleme süreli engellenmesi. Bu bulgu Astrositik reseptör ifadenin belirli bir yaşta statik değil, nöronal aktivitenin seviyelerine bağlı olarak hızla değişebilir öneririz. aksine yetişkin farelerde grup mGluR&#39;lerinin azaltılmış ifadesi, delil dahil &amp; # o adrenerjik reseptörleri ortaya çıkıyor945; 1A, 2A α ve β alt tipleri 1, ağırlıklı olarak, yetişkin beyin 3, 4 ve astrositler tarafından ifade edilmiştir. Α 1A adrenerjik Gq GPCR&#39;dir bu reseptörlerin adrenerjik nöron ateşleme hızlarındaki değişikliklere duyarlı olup olmadığı dahil nöron-to-astrosit iletişimin gelecekteki çalışmalar için çekici bir hedef olabilir.

Astrositler 2 + astrositik Gq GPCRs aktivasyonundan hemen hemen tamamen edilen Sitoplazmik Ca artışlar nöronlar ya da nöronal aksonlarının uyarılmasından saniye içinde yanıt verir. Örneğin muskarinik asetilkolin reseptörleri 1, kanabinoid reseptörleri 2, α 1A adrenerjik reseptörler, 3, 4, ve Grup I mGluR&#39;ler (aşağıya bakınız) akut nöron aktivitesi yanıt her astrositik Gq GPCR alt-tipleridir. Astrositik Grup I mGluR&#39;leri aktivasyonu (örneğin, akut hipokampal dilimler gibi) in situ nöronal glutamaterjik sinirlerin uyarılmasıyla 5-7, hem de in vivo olarak yetişkin fare korteksteki sensor uyarılması 8 takip ediyor, en yaygın olarak gösterilmiştir. Biyoloji ve astrositlerde, nöronlar, ya astrosit nöron etkileşimlerinin fizyolojisi üzerinde sinyalizasyon astrositik Gq GPCR&#39;nin aktivasyonu sonucu tartışma 9-12 meselesi olmuştur. Bu s olacaknöron-to-astrosit reseptör sinyalizasyon işlevi önce ome zaman tam olarak takdir edilmektedir. Bu nöronlar deneysel protokolleri kullanarak Astrositik reseptörleri aktive açıktır iken, yeterince anlaşılamamıştır kalması nöron-to-astrosit reseptör iletişim yönleri vardır. Birincisi, astrositik Gq GPCR&#39;ler etkinleştirmek için gerekli nöronal aktivitenin gerçek miktarı iyi tanımlanmış değildir, ve ikinci, kullanım-bağımlı plastisite sergilemek astrositik reseptörlerinin yeteneği az ilgi gördü. Bu soruları başlamak için, biz son zamanlarda nöronal hareket potansiyelinin uzun vadeli değişiklikler (AP)-bağımlı sinaptik aktivite cevaben Astrositik grubunda akut çocuk hipokampal dilimleri ben mGluR&#39;ler iki yönlü ölçekleme ikna etmek için bir protokol geliştirmiştir. I mGluR&#39;leri fo büyütmek nöronal iyonotropik glutamat reseptörlerinin, 13, 14, astrositik grubunun çift yönlü homeostatik plastisite için keşfedilmiştir ne benzerllowing nöronal hareket potansiyelinin abluka ve nöronal aksiyon potansiyeli frekansı 15 arttığında küçültün. Astrositik reseptörleri bu telafi edici değişiklikler kendiliğinden kaydederek ölçülür ve astrocyte Ca 2 + transientleri uyarılmış ve kontrol koşullarında astrositlerden olanlara bu olayların özelliklerini karşılaştırarak edilebilir. Bu yazıda, astrosit reseptör ölçekleme uyardığı akut hipokampal dilimleri, inkübasyon koşullarının hazırlanması da dahil olmak üzere, bu protokolün kullanımı için tam bir metodoloji tarif astrosit Ca 2 + göstergesi boya yükleme, Ca 2 + görüntüleme konfokal mikroskopi kullanılarak teknikleri ve beklenen etkiler astrocyte Gq GPCR aktivite. Astrosit üzerinde öngörülebilir etkileri Ca2 + sinyali özellikleri - Gq GPCRs farklı ekspresyon seviyeleri ile transfekte edilmiş kültürlenmiş hücrelerde daha önce kaydedilmiş eşleşen - olarak değişiklikler için tahlil sonraki çalışmalarda kullanılabilecek bir &quot;yol haritası&quot; sağlartrocytic GPCR ifade. Bu tekniğin kullanımı için etkileri ve potansiyel uygulamalar, sağlıklı ve hastalıklı beyin astrosit-nöronal etkileşimlerinin anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Chamber Supplies</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:163px;">Brinkmann pipette storage container</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">03-491</td>
			<td style="width:159px;">Use the drawer portion as the incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:163px;">Electrical drill</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Flexible tubing</td>
			<td style="width:135px;">Tygon</td>
			<td style="width:131px;">R-3603</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Silicone seam sealant&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">Also called aquarium seam sealer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Gas tank</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">95% oxygen, 5% carbon dioxide</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Natural beveled pipette tip</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1111-1000</td>
			<td style="width:159px;">Cut-to-fit to connect oxygenate lines</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">One-to-six lines manifold</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">64-0210 &#160;(MP-6)</td>
			<td style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="65" rowspan="2" style="height:65px;width:163px;">Eppendorf microloader</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">5242 956.003</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit</td>
		</tr>
		<tr height="6">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Floating Bubble Rack</td>
			<td style="width:135px;">Bel Art Scienceware</td>
			<td style="width:131px;">F18875-0400</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">600 micron Sefar Nitex nylon mesh</td>
			<td style="width:135px;">ELKO filtering Co.</td>
			<td style="width:131px;">&#160;06-600/51</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Krazy Glue</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:135px;">Baxter</td>
			<td style="width:131px;">1001936060</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">NaCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S271-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">P333-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">CaCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">C79-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">MgCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">M33-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S233-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">53188-07-1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">401471000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Tetrodotoxin citrate (TTX)</td>
			<td style="width:135px;">Ascent Scientific</td>
			<td style="width:131px;">Asc-055</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Sulforhodamine 101 (SR-101)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">284912</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D128-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pluronic Acid F-127</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">P6867</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">O6807</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td style="width:135px;">Ascent</td>
			<td style="width:131px;">Asc-020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Histamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H7125</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Carbamoylcholine chloride (Carbachol)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C4382</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Adenosine 5&#8217;-ATP disodium (Na-ATP)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7699</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Dissection Tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Single-edge razor blade&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GEM</td>
			<td style="width:131px;">62-0161</td>
			<td style="width:159px;">For bisection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Double edge razor blade</td>
			<td style="width:135px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:131px;">121-6</td>
			<td style="width:159px;">For cutting slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Mayo Scissors, supercut</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">14010-15</td>
			<td style="width:159px;">For decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fine iris scissors, straight</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">14094-11</td>
			<td style="width:159px;">For cutting the skull</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Iris forceps, curved</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">15915</td>
			<td style="width:159px;">To remove the skin and skull</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Small spatula</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">To remove/transfer the brain</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-10</td>
			<td style="width:159px;">For hippocampus dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">13-678-20B</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pasteur pipette rubber bulb</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">03-448-22</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Polystyrene 100-mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">25020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Vibratome</td>
			<td style="width:135px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="23" rowspan="2" style="height:23px;width:163px;">Water bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ISOTEMP 210</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For warm incubation</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:163px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:135px;">Narishige</td>
			<td style="width:131px;">PC-10</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:131px;">Olympus Fluoview 1000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">RC-26GLP</td>
			<td style="width:159px;">diamond bath with low profile</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Borosilicate glass pipette</td>
			<td style="width:135px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:131px;">TW150F-4</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="25" rowspan="2" style="height:25px;width:163px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Sutter instrument</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ROE-200</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:163px;">Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 &#181;m cellulose acetate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Costar</td>
			<td style="width:131px;">8161</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing plasticity of astrocytic receptors by manipulation of neuronal firing rates

Araştırmanın iki yıl yakın in situ ve in vivo olarak astrositleri nöronal serbest bırakılan verici tarafından teşvik edilebilir çok sayıda G protein-eşli reseptörü (GPCR&#39;ler) ifade eden oluşturmuştur. Ancak nöron aktivitesi değişikliklere yanıt olarak plastisite sergilemek astrositik reseptörlerinin yeteneği çok az dikkat çekmiştir. Burada küresel büyütmek veya Astrositik grup aşağı ben akut beyin dilimleri glutamat reseptörleri (mGluR&#39;ler) metabotropik için kullanılabilecek bir model sistemi tanımlar. Dahil çift yönlü floresan Ca 2 + göstergesi ile nöronal aksiyon potansiyeli frekansı, yük astrositleri ve astrocyte süreçlerini işlemek, uzun vadeli dilim inkübasyon için uygun odaları oluşturmak, parasagital hipokampal dilimleri hazırlamak ve kayıt ile Astrositik Gq GPCR&#39;dir aktivite değişikliklerini ölçmek için nasıl yöntemler konfokal mikroskopi kullanılarak spontan ve uyarılmış astrocyte Ca 2 + olaylar. Aslında, bir &quot;kalsiyum roadmap &quot;astrositik Gq GPCRs esnekliğini ölçmek için nasıl sağlanmaz. Astrositlerin çalışma için tekniğin uygulamaları tartışılmıştır. Astrositik reseptör sinyal nöronal aktivitedeki değişimlere etkilenir nasıl bir anlayış olması hem normal sinaptik fonksiyonu yanı sıra işlemler altta yatan nörolojik bozukluklar ve nörodejeneratif hastalık için önemli etkileri vardır.

Şekil 3 &#39;de temsil edici sonuçlar sr astrosit Ca 2 + aktivite 4-6 saat boyunca TTX akut fare hipokampal dilimler inkübasyon etkisini göstermektedir. Veri ACSF artı ttx vs kontrol ACSF kuluçkaya dilim kendiliğinden Ca 2 + transientleri ve DHPG-uyarılmış grup I mGluR&#39;daki Ca 2 + tepkilerini, hem de içerir. Temel karakteristik morfolojik özellikleri, stellate süreci montaj ve küçük soma boyutu (~ 10 mikron) dışında, astrositler seçici astrosit işaretleyici SR-101 19 20 ile (Ca 2 + göstergesi KGB-01:00 arasında yayılmasıyla sr tanımlanmıştır Şekil 3A). Astrosit hücre organları üzerinde numaralandırılmış kutular Şekil 3B&#39;de gösterildiği zaman izleri üzerinden numaralı flüoresans tekabül. Grup 1 mGluR agonisti (RS)-3.5-DHPG astrositlerde grup 1 mGluR&#39;leri üzerindeki spesifik ölçekleme etkilerini belirlemek için uygulanır. Fizik arasında ayırımcılıkDiğer Gq GPCRs karşı grup 1 mGluR&#39;lere ölçekleme etkisinin spesifikliği bakımından iology, agonistlerinin bir kokteyl her deney sonunda uygulanır. Burada histamin, karbamilkolin klorür (karbakol) ve adenozin 5&#39;-ATP disodyum (Na-ATP) agonistleri 10 uM Gq GPCR her kullanılır. Agonist kokteyl, aynı zamanda, bu belirli astrositler DHPG bir yanıt ortaya çıkarmak için, reseptörün yeterli miktarda ifade yoktur, çünkü muhtemelen hücreler, DHPG yanıt olmayan durumlarda uygulanabilir, duyarlı astrositler tanımlamak için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. Biz, astrositik Grup I mGluR&#39;leri değişiklikleri ortaya yardımcı olmak için 5 uM ve 15 uM (Şekil 3B) ve 30 uM ve 50 uM (Şekil 4A) de dahil olmak üzere DHPG farklı konsantrasyonlarda, kullanılır. Hücresel Ca2 + tepkileri ve Gq GPCR ekspresyon düzeyleri arasındaki ilişki, daha önce in vitro 21-24 incelenmiştir. İlk olarak,Belirli bir agonist konsantrasyon yanıt için eşik her bir hücre tarafından ifade reseptörlerinin yoğunluğuna bağlıdır. Bir hücre popülasyonunda, daha fazla hücreler hücre reseptörlerinin yüksek yoğunlukları ile transfekte edilir agonistin belirli bir konsantrasyona kadar bir Ca2 + yükselmesi ile yanıt verir. TTX dilimleri inkübasyondan sonra, popülasyondaki yüzde astrositlerin agonist artar sabit bir konsantrasyonunun (Şekiller 3B ve 3C) yanıt. Bu 30 ve 50 uM DHPG 5,0 mM K + &#39;e karşı kontrol tedavi edilen grup I mGluR cevapları karşılaştırmak için gerekli olan ise 5 uM ve 15 uM DHPG, kontrol ve tedavi edilen hücreler arasında TTX duyarlı astrositlerin yüzdesinde belirgin farklılıklar ortaya bulduk hücreleri (Şekil 4A). Astrositik Ca 2 + yanıtı desen ve agonist konsantrasyonu arasındaki ilişki de yerinde incelenmiştir. Agonist artırılmasıkonsantrasyonu, tek bir tepe noktası Ca 2 + 2 + yükseltiler yükseltiler 25-27 Ca multipeak ve yayla için ideal astrositlerde Ca 2 + tepkisinin desen kaydırır. Bu önceki bulgulara dayalı olarak, reseptör ekspresyon seviyesinde bir değişiklik olup olmadığını agonistinin tek bir konsantrasyonu için, yanıt modeli kayacak öngördü. Bu durumda, iki ölçekleme yöntemler (ki nöronal iltihaplanmayı önleyen veya artan) da kullanılmaktadır bağlı olarak, özel bir yanıt biçimine üretmek için gerekli agonist konsantrasyonu artırmak veya azalacaktır. Örneğin, TTX kuluçkaya astrositler daha plato-tipi Ca2 + yükselme için kendi DHPG uyarılmış Ca 2 + yanıt biçimine kayması ve astrositler (Şekil 3C) kontrol ile karşılaştırıldığında daha düşük agonist konsantrasyonu yanıt. Dikkate alarak daha önce yapılan çalışmalar, bu gözlemler, grup I mGluR astrositlerde reseptör ekspresyon seviyeleri artmış olduğunu göstermektedir. Ca 2 + yükselme süresi ve başlangıç ​​(gecikme) Rise doğrudan kültürlenmiş hücrelerde 22-24 Gq GPCR ekspresyon düzeylerinde değişikliklere ilişkili olduğu gösterilmiştir. Reseptör yoğunluğu azalma tersi bir etki üretir iken yüksek reseptör ekspresyon seviyeleri daha kısa tepki gecikmeleri ve hızlı yükselme zamanları neden. TTX, Ca kuluçkaya astrositlere için DHPG uygulaması ile uyarılmış 2 + transientler kontrol ACSF (Şekil 3D) kuluçkaya astrositlere karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha hızlı yükselmeye süreleri var. Agonist ile uyandırılmış Ca2 + tepkilerinin Daha önce de belirtildiği gibi, genlik bağımsız olarak agonist konsantrasyonu ya da ölçekleme modeli 15 (Şekil 3D) değişmeden kalır. Doğrudan aktive edici grubunu tarafından gözlenen değişikliklere ek olarak I mGluR&#39;leri DHPG ile, spontan astrosit Ca 2 + aktivitesi önemli ölçüde bu manipülasyon etkilenir. Biz gözlemlemekkontrolüne karşı TTX kuluçkaya kendiliğinden aktif astrositlerin yüzdesinde da 2.26 kat artış. Bu astrositler (Şekil 3E) kuluçkaya TTX 42,1% &#39;e soma spontan aktivite sergileyen kontrol astrositlerin sadece% 12,9&#39; den bir artıştır. Bilindiği için bu agonistin 21, 26, 28, yokluğu ve reseptör ekspresyon seviyelerinin arttırılması ile bu iç kaynaklı bir etkinlik düzeyi yükseldikçe, bu veriler, in GPCR&#39;ler sergi &quot;içsel&quot; ya da kurucu etkinlik bu astrositik Gq GPCR&#39;ler yoğunluğu arttıkça nöronal aksiyon potansiyeli ateş uzun vadeli azalma takip. Agonist ile uyarılan yanıtlar benzer şekilde, kendiliğinden Ca 2 + yükselmeler yükselişi zamanlar da (Şekil 3E) artmıştır. İkinci protokol, yüksek hücre dışı potasyum (5.0 mM) içinde inkübasyon kullanılarak Örnek veri, Fi gösterilmiştirGüre 4. Hücre dışı K + bazal CA3 nöron hareket potansiyeli frekansı 15 önemli bir artış olarak 2.5-5.0 mM sonuçlarından bir artış. DHPG (30 uM ve 50 uM) Daha yüksek konsantrasyonları yüksek potasyum (Şekil 4A ve 4B) içinde kuluçkalanmıştır astrositlerden Grup I mGluR Ca2 + tepkilerini uyarılması amacıyla gerekli bulunmaktadır. Bu nöronal aksiyon potansiyellerinin uzun süreli artış aşağıdaki astrositlerde Grup I mGluR yanıt azaltılmış bir seviyesi ile tutarlıdır. Buna ek olarak, DHPG bir sabit konsantrasyonuna karşı tepkisi model zayıf tek tepe tepkiler (Şekil 4B) plato-benzeri yanıtlardan geçer. İki potasyum koşullarda kendiliğinden aktif astrositlerin yüzdesini incelenmesi, yüksek K + kuluçkaya az astrositler kontrol koşulu (Şekil 4C) ile karşılaştırıldığında kendiliğinden etkin olduğunu ortaya koymaktadır. Bu etki, buna zıt olanSpontan Ca 2 + yükseltiler sergileyen astrositlerin yüzdesi artar edildiği TTX durumun e yönü. Son iki uyarılmış ve kendiliğinden olan Ca2 + yükselme kontrol koşulu (Şekil 4C ve 4D) karşı yüksek K + kuluçkaya astrositlerde yavaş bir yükselme süresine sahip. Genel olarak bu veriler, astrositik Gq GPCR ekspresyon seviyeleri iki-yönlü şekilde uzun bir süre boyunca hareket potansiyeli nöronal aktivitenin seviyesine bağlı olarak ölçeğe düşündürmektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Dilim inkübasyon odası imalat ve ayarlayın. (A), hava geçirmez bir kapak ile birlikte bir Brinkmann pipet saklama kabının çekmece kısmı dilim inkübasyon odası oluşturmak için kullanılır. (B) Düst kabın yaklaşık 1 ¼ tarafında bir delik ve dere ¼ olarak taraftan. Esnek bir boru parça olarak monte edin. (C), esnek boru iç ucuna Microloader-manifold tertibatı bağlayın. Not cut-to-fit doğal 200 ul pipet ucu (beyaz ok). (D) Altı 20 ul Eppendorf microloaders cut-to-fit olan bir bir-altı satır manifolduna bir Microloader-kollektör cihazı oluşturmak için. (E) kapağı üzerinde iki küçük delik açın. (F) dilim tutucu yapmak için bir Yüzer Kabarcık Raf. (G) naylon örgü malzeme parçası tabanına yapıştırıldı, böylece kayan kabarcık rafın alt &quot;bacaklar&quot; kaldırılır. (H) ACSF yeterli bir miktarı ile inkübasyon odası doldurun dilim tutucu yüzer böylece. Microloaders uçları odasının katında bir köşesinde dinlenme böylece boru uzunluğunu ayarlayın. Inkübasyon odası yerleştirirkensu banyosu, banyo içindeki su seviyesi odası içindeki ACSF ile aynı seviyede olması gerekir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">büyük resim görüntülemek için.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Dilim sağlık Tahmini. (A) diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik kullanan sağlıklı görünümlü hipokampal dilim. Sağlıklı dilimler pürüzsüz, kadifemsi bir görünüm ve sağlıklı CA1 piramidal nöronlar yüksek bir yüzdesi var. Stratum radiatumunun merkezi içine çıkıntı apikal dendrit edin. Burada gösterilenler gibi bakmak nöronların Patch-kelepçe birkaç spontan aksiyon potansiyelleri ile standart 2.5 mM K + ACSF düşük istirahat membran potansiyeli (-61 -62 mV) ortaya koymaktadır. Membran potansiyeli ve ateşleme hızları eski bir fonksiyonu olarak değişirekstrasellüler K + (Xie et al. 15). Oklar varsayılan astrositlere etmektedir. Kısaltmalar: sr, stratum radiatum; s.py., stratum pyramidale. Ölçeği bar, 10 mikron. (B) Sağlıksız dilim kızarmış yumurta (beyaz oklar ölü nöronların çekirdekleri işaret - kızarmış yumurta &quot;yumurta sarısı&quot;) olarak görünüme sahip ölü CA1 piramidal nöronlar yüksek bir yüzdesi, sahip olacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3,. Gq GPCR aktivitesi amplifiye edilmiş ve TTX kuluçkaya bırakılır, nöronal AP uzun süreli önlenmesi sonra uyarılmış Grup I mGluR Ca2 + tepkileri kayıt. (A) kayıt alanında hücre Örnek görsel c inkübeontrol Oregon Yeşil-BAPTA 01:00 Ca 2 + Gösterge boya (sol panel) ve SR-101 (orta panel) almış koşulları (üst panel) veya ttx (alt paneller) içinde. Ölçek çubuğu 10 mikron. Her iki sinyallerin Yerleşimi (&quot;birleştirme&quot;) Ca 2 + göstergesi olduğunu astrositlere yükü gösterir. Kutular astrositlerde Ca 2 + etkinliğini izlemek için yeşil kanal zamanla floresan yoğunluğu kaydetmek için bireysel astrocyte soma üzerine çizilir. Astrositlerde Ca 2 + aktivitesinin A kayıt kutularından (B) Örnek izleri). Yanıtın desen değişiklikler ile kanıtlandığı gibi TTX göstermek kuluçkaya Astrositler spontan aktivite artar ve daha sağlam bir uyarılmış grup I mGluR Ca2 + tepkileri. Tek bir tepe (daire), multipeak (dikdörtgen), ve plato (noktalı dikdörtgen) örnekleri Ca 2 + transientler gösterilmiştir. Cevap desenler (C) değişiklikler, farklı konsantrasyonu derişimi kullanılarak, özellikle belirgindirgrup I mGluR&#39;daki agonist DHPG rasyonlarına. Daha multipeak ve yayla yanıtları belirli bir agonist konsantrasyonu kontrol grubuna kıyasla TTX inkübasyondan sonra belirgindir. Genlikleri (alt panel) değişiklik yok iken (D) &quot;ya hep ya hiç&quot; yanıtı genliklerinin göstergesi, kontrol (üst panel) göre ttx kuluçkaya astrositlerde hızlı DHPG-uyarılmış Ca 2 + tepkilerin kez edilmektedir Rise kez cevap eşik ulaşıldı. (E) kendiliğinden astrosit süreleri Rise Ca 2 + geçici popülasyondaki astrositlerin yüzdesi kendiliğinden Gq GPCR Ca 2 + etkinliği artar (alt panel) sahip iken, astrositler (üst panel) kuluçkalanmıştır aynı zamanda daha hızlı olarak kontrol TTX genel kuluçkalanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-wiDTH = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 4. Yüksek bir hücre dışı potasyum kuluçkaya bırakılır, nöronal AP için uzun süreli kayıt artarak azalan astrositik Gq GPCR aktivitesi ve uyarılmış Grup I mGluR Ca2 + tepkileri. (A) 5.0 mM K + ACSF kuluçkalanmıştır kesitlerden astrosit Ca 2 + kayıtların Örnek izleri nöronlar depolarize ve ACSF (2.5 mM K + ACSF) kontrol karşılaştırıldığında bazal atış oranını artırmak için. 5.0 mM K + ACSF sergi daha az spontan somatik Ca 2 + geçici ve zayıf DHPG ile kuluçkaya Astrositler kontrol ACSF kuluçkaya astrositlere göre tepkiler. (B) DHPG birden konsantrasyonlarda uyarılmış yanıtların kalıplarının karşılaştırılması nöronal AP uzun vadeli yükselişin ardından daha zayıf tepki türleri ortaya koymaktadır. Po astrositlerin yüzdesi olarak (C) bir azalmaspontan aktivite yükselmesi kat daha yavaş (alt panel) olmak ise kendiliğinden Ca 2 + aktivite sergileyen pulation, yüksek K uzun süreli kuluçkadan sonra gözlenen + ACSF (üst panel) kontrol etmek için karşılaştırılır. (D) DHPG değişik konsantrasyonlarda uyarılmış astrosit süreleri Ca 2 + tepkileri Rise kontrol ACSF kuluçkaya astrositlere kıyasla 5.0 mM K +, tedavi sonrasında daha yavaş olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates at JoVE.com

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Burada astrositik G-protein bağlı reseptörlerin plastisite çalışma için nöronlarda homeostatik plastisite indüklemek için kullanılan protokol bir uyarlama tarif eder. En son astrositik grubu çocuk farelerde I mGluR&#39;leri değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntem, in situ ve in vivo olarak erişkin farelerden dokuda çeşitli astrositik GPCRs ölçekleme ölçülmesi ve astrositik reseptörlerinin duyarlılığının daha iyi takdir elde etmek için uygulanabilir nöronal aktivite değişikliklere.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Görüntüleme.  University of California Riverside.  Burada astrositik G-protein bağlı reseptörlerin plastisite çalışma için nöronlarda homeostatik plastisite indüklemek için kullanılan protokol bir uyarlama tarif eder. En son astrositik grubu çocuk farelerde I mGluR'leri değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntem, in situ ve in vivo olarak erişkin farelerden dokuda çeşitli astrositik GPCRs ölçekleme ölçülmesi ve astrositik reseptörlerinin duyarlılığının daha iyi ta...

Video: Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Nörobilim

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Lazer Tarama Photostimulation tarafından inhibitör nöronal devreler Haritalama

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Bir<em&gt; İn Vitro</emKas afferentlerin tahrik Properties incelenmesi için&gt; Yetişkin Fare kas-sinir Hazırlık

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Pentylenetetrazole kaynaklı çıra fare modeli

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have become the most popular chemogenetic approach used in modern neuroscience. Most studies deliver the ligand clozapine-N-oxide (CNO) using a single intraperitoneal injection, which is suitable for the acute activation/inhibition of the targeted neuronal population. There are, however, only a few examples of strategies for chronic modulation of DREADD-controlled neurons, the majority of which rely on the use of delivery systems that require surgical intervention. Here, we expand on two non-invasive strategies for delivering the ligand CNO to chronically manipulate neural population in mice. CNO was administered either by using repetitive (daily) eye-drops, or chronically through the animal&#39;s drinking water. These non-invasive paradigms result in robust activation of the designer receptors that persisted throughout the CNO treatments. The methods described here offer alternatives for the chronic DREADD-mediated control of neuronal activity and may be useful for experiments designed to evaluate behavior in freely moving animals, focusing on less-invasive CNO delivery methods.

Here we describe two non-invasive methods to chronically control neuronal activity using chemogenetics in mice. Eye-drops were used to deliver clozapine-N-oxide (CNO) daily. We also describe two methods for prolonged administration of CNO in drinking water. These strategies for chronic neuronal control require minimal intervention reducing animals&#8217; stress.

DREADD kontrollü Nöronal Aktivitekronik Manipülasyon için Non-invaziv Stratejiler

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...