Bu protokol kullanılarak, döteryum oksit veya D2O, radyoaktif olmayan, istikrarlı bir su izotopu, vücut bileşimi ve su tüketimini tahmin etmek için kullanılabilir. Bu teknik noninvaziv ve bu nedenle nesli tükenmekte olan türlerin vücut kompozisyonu değerlendirmek için kullanılabilir, yanı sıra insanlar ve evcil türler. Döteryum oksit seyreltme tekniğinin benzersiz bir uygulaması, yüksek yeniden yakalama oranları veya sosyal olarak barındırılan hayvanların serbest yaşam su tüketimini ölçmek için yeteneğidir.
Anestezi gerekli olmasa da, döteryum oksit teslim etmeden önce hayvanları yatıştırmak için deri altı enjeksiyonları veren yabancı olanlar için daha kolay olabilir. Sarah Hooper ve benimle prosedürü gösteren Amanda Eshelman ve Ashley Cowan, veterinerlik öğrencileri ve Alicia Roistacher, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Litre tuzlanmış döteryum oksit başına dokuz gram 50 mililitrelik stok çözeltisi yapmak için, ilk ilaç dereceli sodyum klorür 450 miligram ağırlığında, ve dört ondalık yerlere tam miktarı kaydetmek.
Tüm tuzu sterilize edilmiş 100 mililitrelik bir kabın içine aktarın ve steril, mezun silindirdeki %99,8'den daha büyük veya %99,8 döteryum oksitten 50 gram daha fazla veya eşit ölçün. Döteryum oksitin tam miktarını dört ondalık basamaklara kaydedin ve döteryum oksitini sodyum klorür kabına aktarın. Daha sonra, 10 mililitrelik şırınga fıçısı ile donatılmış submikron gözeneklerine sahip pirojenik olmayan steril disk filtresine 20 kalibrelik bir iğne takın ve iğneyi steril, boş, 100 mililitrelik bir şişenin septumuna takın.
22 kalibrelik bir iğneye vakum tüpü takın ve iğneyi 100 mililitrelik şişenin septumuna takın. Sonra şırınga varil içine izosmotik mukavemeti sodyum klorür 10 mililitre yük ve döteryum oksit çözeltisi yavaş yavaş şişe içine filtre başlayana kadar yavaşça vakum açın. 50 mililitrelik hacmin tamamı filtrelenene kadar döteryum oksit stok çözeltisini şırınga namlunun içine dökmeye devam edin.
Anestezili bir yarasada parmak kıskacına yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, interfemoral ven üzerinde üropatagium temizlemek için bir alkol hazırlık pedi kullanın ve dezenfekte kuyruk zarının kurumasını bekleyin. Interfemoral ven üzerine petrol jöle ince bir tabaka uygulayın ve interfemoral ven dorsal kısmını delmek için 29-gauge iğne kullanın. Sonra kan 100 mikrolitre toplamak için plastik sodyum heparin kılcal tüpler kullanın.
Sodyum heparin ile tüm kanın yeterli bir karıştırma sağlamak için, yavaşça etiketleme önce kan toplama sonra her tüp rulo. Enjekte etmek için gram döteryum oksit kütlesini belirledikten sonra, döteryum oksit uygun hacmi ile 29-gauge iğne ile donatılmış bir insülin şırınga yükleyin. Döteryum yüklü insülin şırıngasını ve iğnesini tartın, ağırlığı dört ondalık basamaklara kaydedin ve döteryum oksit hacminin tamamını anestezili yarasanın dorsal kalça bölgesine subkutan olarak enjekte edin.
Antistatik taslak kalkanlı hassas bir ölçek kullanmanızı ve enjekte edilmeden önce negatif basınç sağlamak için pistonu geri çektiğinden emin olmamızı öneririz. Enjeksiyondan hemen sonra, şimdi boş olan insülin şırıngasını ve iğnesini tarayın ve ağırlığı dört ondalık basamakta kaydedin. 30 dakika sonra kan toplama, beş dakika boyunca 10, 000 kez g her kılcal tüp aşağı spin için bir hematokrit santrifüj kullanın.
Keskin makas kullanarak, tüm kan ve plazma arasındaki plastik kılcal tüpü kesin ve plazmayı doğrudan etiketli, 500 mikrolitrelik bir depolama tüpüne atmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Equilibr döneminden sonra, toplamak ve sadece gösterildiği gibi interfemoral ven kan başka bir 100 mikrolitre saklamak. FTIR spektrofotometri analizi için, damıtmayı kolaylaştırmak için kum banyosunun sıcaklığını 60 dereceye ayarlayın ve her plazma numunesinin ve standardın 50 mikrolitresini ayrı 1,5 mililitrelik konik mikrosantrifüj kapaklarına ekleyin.
Mikrosantrifüj kapağını baş aşağı tutarak, 1,5 mililitrelik konik mikrosantrifüj tüpünü kapağın üzerine vidalayın ve ters dönmüş tüpü en az 12 saat boyunca kum banyosundaki kumbanyosuyla temas halinde yerleştirin. Ertesi sabah, her tüp üzerine yeni, temiz bir kapak yerleştirin ve mikrosantrifüj tüpleri 10 saniye boyunca mikrosantrifüj bir mikrosanjıfuge darbe. FTIR spektrometresine sıvı iletim hücresi tonuyla bir sıvı iletim hücresi tonuyla doldurun ve hücreyi metanolle doldurun.
Enjeksiyon bağlantı noktasını bağlayın ve hava kabarcıkları riskini azaltmak için metanol şırıngasını dikkatlice çıkarırken hücreyi yavaşça arka plan suyuyla doldurun. Analiz sonrası numunelerin kaldırılmasına izin vermek için çıkış portuna boru takın ve FTIR spektrometre yazılımını açın. Parametreleri tabloya göre ayarlayın ve 0,22 mikrometre filtrelenmiş, distile su ile bir arka plan örneği toplayın.
Milyon döteryum oksit standardı başına sıfır parçadan 40 mikrolitre enjekte edin ve hayaletten ayrılmış değerler dosyası olarak spektrumları kaydedin ve kaydedin. Standart bir eğri oluşturmak için tüm standartların spektrumlarını enjekte edip kurtardıktan sonra, her distile numunenin 40 mikrolitresini sıvı iletim hücresine enjekte edin ve spektrumdan tasarruf edin. Bilinen bir denge süresi ile, toplam vücut suyu, yağsız vücut kütlesi, ve vahşi yakalanmış büyük kahverengi yarasalar ve esir büyük kahverengi yarasalar için vücut yağ kütlesi belirlenebilir.
Negatif bir vücut yağ kütlesi aşağıdaki nedenlerden biri veya daha fazlası nedeniyle hesaplanabilir:döteryum oksit tüm doz alma, denge aşamasında torpid olma, anormal büyük yağ kitleleri ve minimal yağsız kitleler ekibe sahip, ya da altında sahip 3-5% çift x-ışını emilimi tarafından belirlenen vücut yağ. Burada çift x-ışını emilimine göre döteryum oksit seyreltme tekniği ile belirlenen vücut yağlarının temsili bir yüzdesi gösterilmiştir. Bu iki teknik iyi korelasyon, vücut yağ kütlesi vücut yağ ve vücut ağırlığı arasında güçlü korelasyon gösteren ve döteryum oksit seyreltme tekniği ile sürekli üzerinde veya vücut yağ kütlesi hafife değildir.
Döteryum oksit seyreltme yöntemi daha önce kedilerde doğrulanmış ve bu teknik, deneyin her diyet bloğu nda sosyal olarak barındırılan kedilerin günlük su tüketiminin ölçülmesine olanak sağlayacak şekilde uyarlanmıştır. Bu tekniğin sadece sağlıklı hayvanlar üzerinde yapılması gerektiğini ve her hayvana tam doz döteryum oksit vermeniz, kaydetmeniz ve doğru bir şekilde tartmanız gerektiğini unutmayın. Döteryum oksit tekniğini doğrulamak için tam karkas analizi veya DEXA gibi gövde kompozisyonunu belirlemek için ikincil bir yöntem tamamlanabilir.
Bu teknik, her kediyi su tüketimini ölçmek için ayırmadan anormal derecede yüksek miktarda su tüketen, sosyal olarak barındırılabilen bir kediyi tanımlamamızı sağladı.
