Göbek kordonkan ünitesinden hematopoetik kök hücrenin ek vivo genişlemesi rejeneratif tıp ve transplantasyon tedavisinde HSC uygulaması için büyük umut vaat ediyor. Bu protokol, valproik asit tedavisi ile birlikte bir sitokin kokteyli kullanarak primer ilkel HSC'lere çok benzeyen özelliklere sahip çok sayıda fonksiyonel HSC'yi hızla genişletmektedir.
Bu yöntem, şu anda kullanılan gen modifikasyon protokolleri için geçerli olan bir süre içinde daha fazla sayıda genetiği değiştirilmiş hücrenin üretimi için yararlı olabilir. Valproik asit ex vivo genleşme protokolü nispeten basit ve güvenilirdir. CD34-pozitif hücrelerin hücre ayırıcı cihazı ile saflaştırılması son derece tekrarlanabilir ve hızlıdır, bu da yüksek oranda saflaştırılmış CD34-pozitif hücrelerin hızlı bir şekilde kurtarılmasına olanak sağlar.
24 saat önce göbek kordon kanı CD-34 pozitif hücrelerin izolasyon, 0.5 molar EDTA iki mililitre ve 33 mililitre 7.5% BSA 465 mililitre 1X PBS ekleyerek ayırma tampon hazırlayın. Tamponu hafifçe karıştırın ve bir gecede dört santigrat derecede muhafaza edin. Arınma gününde, ortam oda sıcaklığına ısıtın.
Tüm göbek kordonu kan ünitesini 75 santimetre karelik bir şişeye dağıtın. Oda sıcaklığında eşit miktarda PBS ile kanı seyreltin ve hafifçe karıştırın. Daha sonra, tüm göbek kordonu kan birimi işleme için gerekli tüplerin sayısını belirleyin.
Her tüpe 15 mililitre yoğunluk gradyan ortam ekleyin. İki katman oluşturmak için tüpü 45 derecelik bir açıyla tutarken seyreltilmiş kanı yoğunluk degradesinin üzerine çok yavaş bir şekilde dağıtın. Düşük hızlanma ve yavaşlama hızı ile tüpü 400 g'da 30 dakika santrifüj edin.
Santrifüjden sonra mononükleer hücreler plazma ve yoğunluk gradyan ortam katmanları arasındaki beyaz tabakada yer alacaktır. Buffy coat tabakasını yeni, 50 mililitrelik bir tüpe dikkatlice aktarın. 25 mililitre ulaşana kadar 50 mililitrelik bir tüp içine aynı göbek kordon kan ünitesinden mononükleer hücrelerin tüm toplayın.
25 mililitre mononükleer hücre içeren tüpe 25 mililitre soğuk PBS ekleyin ve iyice karıştırın. Santrifüj 400 g ve 4 santigrat derecede 10 dakika. Dikkatle supernatant aspire ve soğuk PBS 50 mililitre hücre pelet resuspend.
Bundan sonra, saymak için hücre süspansiyon 20 mikrolitre çıkarın. Acridine turuncu veya propidium iyodür ile boyanmış hücre sayısını saymak ve toplam mononükleer hücre sayısını hesaplamak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Sonra, hücreleri 400 g ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj edin.
İlk olarak, 10 milyon mononükleer hücreden CD34-pozitif hücreleri izole etmek için insan FCR insan IgG 100 mikrolitre ve CD34 manyetik boncuk 100 mikrolitre ile ayırma tampon 300 mikrolitre karıştırın. Daha sonra, daha önce santrifüj edilmiş mononükleer hücrelerin bir tüpten supernatant dikkatlice çıkarın. 10 milyon hücre başına 500 mikrolitre kullanarak manyetik boncuk çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın.
Yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca dört derece santigrat de kuluçka. Kuluçka sırasında, depolama çözümlerini çalışan tamponla değiştirerek ve ardından bir yıkama programı çalıştırarak hücre ayırıcı cihazını hazırlayın. Daha sonra, tüp tamamen dolana kadar hücre karışımı içeren tüp için tampon çalışan soğuk hücre ayırıcı ekleyin.
Tüpü 400 g ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj edin. Supernatant aspire ve 10 milyon hücre başına iki mililitre kullanarak tampon çalışan soğuk ayırıcı hücre pelet resuspend. 15 mililitrelik tüpler içine iki mililitre hücre süspansiyon karışımı aktarın.
Tüplerin üç setini, önceden soğutulmuş olan hücre ayırıcı rafına yükleyin. Tüpler bir dizi MMCs içerir, tüplerin ikinci seti negatif fraksiyonu toplamak için kullanılacak, ve tüpler üçüncü bir set saf CD34-pozitif hücreleri toplamak için kullanılacaktır. Rafı hücre ayırıcı cihazına yükleyin ve önceden ayarlanmış programı çalıştırın.
Bundan sonra, 400 g ve dört derece santigrat pozitif fraksiyonu içeren tüpler 15 dakika santrifüj. Süpernatant aspire ve serum içermeyen medya bir mililitre safCD34-pozitif hücreleri resuspend. Daha sonra, acridine turuncu veya propidium iyodür ile boyanmış hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın.
İlk olarak, saflaştırılmış CD34-pozitif hücreleri mililitre başına 33,000 hücre yoğunluğunda plakalamak için yeterli miktarda ortam hazırlayın. Saflaştırılmış CD34 pozitif hücreleri, her kuyuda 1,5 mililitre lik bir hücre yoğunluğunda 12 kuyuluktaki bir plakaya yerleştirin. %5 karbondioksit nemlendirilmiş kuluçka makinesinde 37 derecede 16 saat kuluçka ya.
Son konsantrasyon bir milimolar olduğunu kültürlere valproik asit ekleyin. Hücreleri yedi gün daha aynı koşullarda ek olarak ek olarak ekleme devam edin. Bu ex vivo protokolde, göbek kordon uğundan izole edilen CD34 pozitif hücrelerden üretilen ilkel hematopoetik kök hücrelerin sayısı artmaktadır.
Tek başına sitokin kokteyli ile tedavi edilen kültürlerde çekirdekli hücrelerin toplam sayısı önemli ölçüde daha yüksektir. Toplam çekirdekli hücre sayısının artmasına rağmen, sitokin kokteyli alan kültürlerdeki hematopoetik kök hücre sayısı, sitokin kokteyli ve valproik asit le tedavi edilen kültürlere kıyasla tüm genişleme döneminde düşük kalır. Hematopoetik kök hücrelerin en çok sitokin kokteyl ve valproik asit kombinasyonu ile tedavi kültürlerde oluşturulur.
Özellikle valproik asit ile tedaviden beş ila yedi gün sonra en büyük genişlemeye ulaşılır. Hematopoetik kök hücre bu artan sayıda valproik asit ile tedaviden sonra 24 saat içinde kayda değer hematopoetik kök hücre yüzdesinde hızlı bir artış ile ilişkilidir. Yüzdedeki artış ex vivo kültürünün ilk dört gününde korunurken, beş ila yedi günlük tedaviden sonra giderek azalır.
Ancak, bu azalma ters hematopoetik kök hücrelerin mutlak sayısındaki bir artış ile ilişkilidir. Valproik asit ile tedavi edilen kültürlerde hematopoetik kök hücre yüzdesinde hızlı artış CD90 fenotip edinimi kaynaklanmaktadır. CD90'ı ifade eden CD34-pozitif hücreler, sitokin kokteyli ve valproik asit ile dört gün boyunca tedavi edilen ex vivo kültürlerde genişleyen hücrelerin neredeyse %40-50'sine ulaşır.
CD90 fenotip edinimi daha sonra CD90 belirteci ifade eksikliği yüksek saflaşmış CD34-pozitif hücrelerin ex vivo genişleme ile doğrulanır. Valproik asit ile tedaviden sonraki 24 saat içinde, ex vivo genişletilmiş hücrelerin neredeyse %75'i CD90'ı ifade eder. Bu fenotip bu kültürlerde ilk dört gün boyunca yüksek oranda korunur.
Seyreltilmiş kordon kanı, iki farklı katman oluşturmak için tüpü 45 derecelik bir açıyla tutarken yoğunluk degradesinin üzerine çok yavaş bir şekilde dağıtılmalıdır. Bu ex vivo genişleme prosedürü nden sonra, genişletilmiş hücreler işlevselliklerini ve engraftment potansiyelini test etmek için miyeloablated bağışıklık eksikliği NSG fareler içine enjekte edilebilir. Genişletilmiş hücreler, hem insan hem de fare HSC'nin biyolojisi ve farklı genlerin veya kritik oyuncunun HSC'lerin işlevsel bütünlüğü üzerindeki rolü ile ilgili çeşitli soruları test etmek için kullanılabilir.
Bu tekniği kullanarak insan göbek kordonu kan ünitesinden ex vivo genişletilmiş HSC işlevselliği, allojenik kemik iliği nakli gerektiren hematolojik maligniteleri olan hastada klinik bir çalışmada yakında test edilecektir. Bu teknik aynı zamanda VPA tedavisi ile ex vivo expansion'ın altında yatan mekanizmayı araştırmamıza ve ilkel HSC'lerin biyolojisi hakkında bilgi edinmemize olanak sağlamıştır.
