Yazarlar yazının yararlı yorumlar, Daniela Thaler ve Margaretha Fr hwirth teknik yardım için, dil düzenleme için Monica Farrell, Uwe Lang, Margit Holzapfel ve Kadın Hastalıkları Bölümü Sandra Eppich pHPL, Eva Rohde ve Nicole Hofmann sağlamak için Katharina Schallmoser teşekkür Kabloları sağlamak için. Bu çalışma, Avusturya Araştırma Vakfı (FWF, DS hibe N211-NAN), Avusturya Araştırma Promosyon Ajansı (FFG, hibe N200 DS) ve Yetişkin Kök Hücre Araştırma Vakfı (AR) tarafından desteklenmiştir. AR doktora programı Graz Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıp üyesidir.

Bölüm 1: ayarlama 1. Hücre kültür ortamı hazırlanması Orta hazırlığı başlamadan önce tüm malzemeleri ve gereken araçlar topluyoruz. Çözülme 2 toplanmış insan trombosit lizat x 56 ml alikotları (pHPL, kendi kendine: Referans 1 ve Jüpiter # 1523), 100x Penisilin / Streptomisin çözümü, 2 adet 10 ml x 5 ml L-Glutamin (Sigma hem). EGM-2 orta boy (Lonza) 1 şişe (500 ml) ek için ayarlanan sitokin ve büyüme faktörü alikotları (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hidrokortizon, Amfoterisin &#39;tek quots&#39; olarak askorbik asit, heparin,) Çözülme. Buzdolabından bir adet 500 ml şişe (i) her minimal temel orta alfa-modifiye (MEM) ve (ii) endotel bazal, orta (KDT). Aşağıdaki adımları, steril koşullar altında bir laminer akış doku kültürü kaputu yapılmaktadır. 1000 IU / mL steril su ile son bir konsantrasyon toz eriterek, koruyucu içermeyen heparin (örneğin, Biochrom) hazırlayın. MSC-Orta: 500 mL-MEM kullanın çözülmüş pHPL 56 ml (da daha fazla ayrıntı için 1 referans) ve 2 IU / mL (= 224 ul stok solüsyonu), koruyucu içermeyen Heparin (orta, topaklanma yoluyla koagülasyon önler eklemek plazma fibrinojen)% 10 pHPL bir final konsantrasyonuna ulaşmak için. Ayrıca Penisilin (100U/mL) / Streptomisin (100μg/mL) çözüm ve L-glutamin 2mm (Sigma hem) ekleyin. 20 mikron gözenek boyutu vakum filtresi (Millipore) ile orta Filtresi. (Içerik, tarih) uygun şişe etiketi. ECFC-Orta: EBM bir şişe (500 ml) kullanın ekleyin, sitokin alikotları, koruyucu içermeyen Heparin pHPL, 10 IU / ml (= 1120μl stok solüsyonu) 56 mL, Penisilin (100U/mL) / Streptomisin (100 g / ml) solüsyonu ve 20 ul-gözenek boyutu vakum filtresi (Millipore) ile bazal, orta ve filtre L-glutamin 2mm. (Içerik, tarih) uygun şişe etiketi. 2. Cerrahi aletlerin sterilizasyon Forseps, cerrahi makas ve neşter sahibinin keskin çifti ısı sterilize cevheri steril tek kullanımlık olmalıdır. 3. Kordon koleksiyonu için tüplerin hazırlanması 50 ml polipropilen tüpler (Falcon) ücretsiz heparin ve son hacim 20 ml PBS ile uyum - 500 IU koruyucu ekleyin. Tüpleri teslim odasına aktarın. 4. Aydınlatılmış onam (yerel etik kurul veya IRB tarafından onaylandıktan sonra). Kablonun bir parça bağış ve yeterli hizmet amaçları onları bilgilendirmek istiyorsanız teslimat için önce anne ve babalar sorabilir. 5. Kordon bağış Plasenta ve kord teslimat ve teftişin 10 cm bir parça kesti ve hemen kordon damarları içindeki kalan kanın pıhtılaşma önlemek için heparin ile önceden doldurulmuş tüp transferinden sonra. En kısa sürede hücre izolasyonu ile devam edin. Bölüm 2: Hücre izolasyonu <ol><li> Incidin veya% 70 EtOH yüzeylerin temizlenmesi, laminer akış doku kültürü kaputu hazırlayın. Yeri steril 150 cm 2 hücre kültürü tabak, 75 cm hücre kültürü şişeleri (Corning), PBS, steril cerrahi aletler, cep kazıyıcılar, tüp tutucu, 25 ml stripettes ve 5 ml şırınga temizlenir kaputu uygun künt sonunda iğne ile donatılmış. </li><li> Pre-sıcak hazırlanan α-MEM ve EGM-2 hücre kültürü orta 37 ° C su banyosu. </li><li> Doğumhane hücre kültürü kaputu ile donatılmış laboratuvar kablosu getirin. Laminer akım kablosunun aktardıktan sonra, kan hücrelerinin kontamine kurtulmak için (yeni bir plaka transfer) PBS içinde iki kez yıkayın. Umbilikal ven kablosunun diğer ucunu çıkan sıvı kadar PBS ile künt sonunda iğne ile donatılmış steril bir 5 ml&#39;lik şırınga ile bir tarafta canulating sonra durulayın (kırmızımsı kan kontaminasyonu gösterir) tamamen şeffaf hale gelir. </li></ol> ECFCs: <ol start="4"><li> 75 cm 2 balonuna (Corning) hazırlayın, etiket ve önceden ısıtılmış EGM-2 orta 15-20 ml doldurun. </li><li> Kablosu steril PBS ile dolu yeni bir tabak içine yerleştirin. Cerrahi makas alın ve yaklaşık 5 cm uzunluğunda iki adet (göbek damarları kendi ekseni boyunca bükülmüş, çünkü kısa parçalar, süreci daha kolay) içine göbek kordonu kesmek. </li><li> Umbilikal ven (büyük damar) bulmaya çalışın cerrahi makas, bir bıçak yerleştirin ve uzunlamasına damar kesmek. Bu noktada daha engellerken, bir asistan, iki forseps ile zaten kesilmiş damar tutabilir yararlı olabilir. </li><li> Kord pasta yerleştirin.ce PBS olmadan yeni plaka kesme damar, hücre kazıyıcı ve bir ucundan diğer rubbings umbilikal ven iç (endotel) yüzey kazıma alır. Orta sıyırıcı ucu temizleme hazırlanmış balona hücrelere aktarın. Bu işlem en az 10 kez tekrarlayın. </li><li> Şişeyi kapatın ve içine koymak, bir kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO 2,% 95 nem) . </li></ol> MKH: <ol start="4"><li> 150 cm 2 kültür plakasına (Corning) hazırlayın ve etiket. </li><li> (Endotel tabakası kazıyarak sonra) kablosunun parça alın ve steril makas ve steril bistüri ile çok küçük parçalar halinde tüm kablosunu kesip. Kord adet maksimum boyutu 1-2 mm olmalıdır. </li><li> Önceden etiketli kültür plakasına steril forseps ile kordon adet aktarın. Plaka orta ile doldurmadan önce 5 dakika boyunca açık bırakarak, plastik yüzey adet ek güçlendirilmiştir. </li><li> Kord adet plastik uygun bağlandıktan sonra, yavaşça 30-35 ml MEM değiştirilmiş önceden ısıtılmış alfa ekleyin. Tüm parçaları takılı kalması emin olmak için en düşük hızda kullanmayı deneyin. </li><li> Tabak kapatın ve içine koymak, bir kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO 2,% 95 nem) . </li></ol> Bölüm 3: Hücre genişlemesi ve flow sitometri ile bağışıklık-fenotip onay Hücre Genişleme EFCFs: <ol><li> Ters bir mikroskop ve döviz endotelyal hücrelerin ek bir sonraki gün kontrol edin bütün EGM-2 bağlı olmayan tüm hücreleri ve parçacıkların kurtulmak için orta. </li><li> Orta izdiham ve döviz üçte biri haftada iki kez kadar hücreleri genişletin. Izdiham ulaşıldığında,% 0.05 &#39;Trypsin/0.7 mM EDTA hücreleri ayırmak ve yeni bir kültür gemilere aktarmak. Sizin T75 şişesinin içinde hücrelerinin sayısına bağlı olarak, daha da genişlemesi için düşük ekim yoğunluğu garanti altına almak için yeni şişeler sayı ve büyüklüğü seçmelisiniz. </li><li> Exchange üçte biri haftada iki kez hücrelerinin genişlemesi sırasında orta. </li></ol> MKH: <ol><li> Kabloyu MKH akıbet daha fazla zaman alacaktır, bu yüzden bağlı doku parçaları çevrede iğ şekilli hücreler görünüm için ters bir mikroskop kadar en az 3-4 gün bekleyebilir. Yeterli hücre dışı büyüme olduğunda, adet plastik ile temas kaybı nedeniyle ayırmak için eğilimindedir. </li><li> 10-12 gün doku parçaları kaldırdıktan sonra,% 0.05 &#39;Trypsin/0.7 mM EDTA ile plastik MKH ayırmak ve yeni bir kültür damarlarının aktarabilirsiniz. Plağındaki hücrelerinin miktarına bağlı olarak daha da genişlemesi için düşük ekim yoğunluğu garanti altına almak için yeni şişe büyüklüğü ve sayısına karar. </li><li> Exchange üçte biri haftada iki kez hücrelerinin genişlemesi sırasında orta. </li></ol> Flow sitometri Gerekli ekipman: Akış sitometresi (BD FACSCalibur), mikronik tüpleri (Corning), tüp tutucu, koyun serum (reaktif engelleme), Eppifuge (Eppendorf), monoklonal antikorlar MKH: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, izotip kontrol ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, izotip kontrol <ol><li> Izdiham ulaştıktan sonra, 4 dk 7 300g 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ve santrifüj hücre ayırmak ° C </li><li> Modifiye PBS ve% 10, 4 dakika 20 v / v koyun serum ° C blok belirsiz antikor bağlanma 1x10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon hücreleri yeniden süspanse </li><li> Etiket mikronik tüpleri ve floresan etiketli antikorlar uygun konsantrasyonda ekleyin. </li><li> Her bir tüp hücre süspansiyonu (bloke) 50 ul ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe 4 ° C </li><li> Bağlayıcı olmayan antikorlar kaldırmak için modifiye PBS ekleyerek hücrelerin yıkayın. </li><li> Akış sitometresinin etiketli hücre ile gidin ve analiz yapmak. </li></ol> Bölüm 4: ECFC koloni büyüme, fiksasyon, boyama ve hiyerarşi analizi <ol><li> Tohum santimetre kare başına 3 veya 10 hücre hücre kültürü plakaları çok düşük kaplama yoğunluğu neredeyse saf hasat ECFCs tek koloni büyümesi için izin vermek. </li><li> Exchange üçte biri haftada iki kez orta. </li><li> 14 gün (kültür sonu) orta kaldırdıktan sonra, PBS ile iki kez yıkayın ve buz gibi fiksasyon çözüm (Aseton 2: Metanol = 3) koloniler düzeltmek buzdolabında 15 dakika boyunca. </li><li> Fiksasyon çözüm atın ve plakalar 10 dakika kuruması için açık bırakın. </li><li> Distile su ile 10 dakika hücreleri rehidrate. </li><li> Harris hematoksilen çözeltisi ekleyin ve 12 dakika boyunca sabit koloniler leke. </li><li> H matoxylin çözüm çıkarın ve kalan boyama çözüm kurtulmak için musluk suyu ile plakalar durulayın. </li><li> Her koloninin fotoğraflar çekinstereomikroskopta ve ithalat kullanarak *. jpg veya bilgisayarınıza *. tif formatındaki dosyalar. </li><li> ImageJ yazılımı ile fotoğrafları açın ve animasyon açıklandığı gibi her koloninin doğru hücre sayısı analiz. </li><li> ImageJ yazılımını açın ve menü aşağı çekme &#39;Dosya \ Open&#39; fonksiyonunu kullanarak bir koloni resmi ithalat. </li><li> Fonksiyonu &#39;\ çıkart Arkaplan Süreci&#39; ile devam edin </li><li> Koloni marjı işaretlemek için ImageJ menüsünde &#39;* eliptik veya fırça seçimi&#39; işlevini kullanın. </li><li> &#39;Düzenle \ Clear dışında&#39; fonksiyonu ve kırpma &#39;\ kırpma&#39; seçilerek resmi kullanarak, çevredeki görüntü temizleyin. </li><li> Kullanarak elle ayarlayabilirsiniz.Özellik &#39;Resim \ \ Eşik ayarlayın&#39; tüm hücreleri tamamen kırmızı renkli, böylece fonksiyonu. </li><li> &quot;Analyze \ analiz Parçacıklar &#39;seçerek koloni hücre sayısını saymak. Uygun ayarları (her bir hücre tipi için optimize) seçin ve &#39;OK&#39; i seçin. Hücre sayımı ve sayılan hücrelerin karşılık gelen ana hatlarını içeren bir yeni görüntü de dahil olmak üzere sonuçları kutusunda görünecektir. <img src="/files/ftp_upload/1525/1525op2.jpg" alt="Şekil 1" /></li></ol>

<ol>
	<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells.">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application.">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo.">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li><li>Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+preclinical+production+of+human+lineage-negative+cells+for+regenerative+stem+cell+therapy.">Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy.</a> Transfusion. 45, 315-326 (2005).</li></ol>

Yazarlar, herhangi bir mali çatışmalar faiz beyan etmek zorunda değilsiniz.

Kemik iliği, yağ dokusu, kordon kanı, vb de dahil olmak üzere MKH veya ECFCs almak için çeşitli kaynaklardan vardır Bu doku ve damar yenilenme veya tümör progresyonu katkı gibi süreçlerde farklı hücre tiplerinin doğrudan katılımını karşılaştırmak için aynı kaynaktan atalarıdır iki türlü elde etmek için gereklidir. Izole etmek ve daha sonra aynı donörden ECFCs ve MKH otolog çiftleri çalışma kolaylığı olan bu yöntem bireysel...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>alpha modified MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-GLutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EBM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single cytokine quots</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75 cm2 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>150 cm2 plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell scraper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin/EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoclonal antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>500 mL filter 20 &mu;m pore size </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Preservative free heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (mscs) and endothelial colony forming progenitor cells (ecfcs)

Göbek kordonu, mezenkimal stromal hücreler (mezenkimal kök hücreler olarak da adlandırılır, MKH) ve endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) de dahil olmak üzere yüksek proliferatif potansiyele sahip progenitör hücreler için zengin bir kaynaktır. Her iki hücre tipleri, doku bütünlüğünün korunmasında anahtar oyuncular ve muhtemelen de rejeneratif süreçleri ve tümör oluşumu ilgilidirler. Biyoloji ve karşılaştırmalı bir şekilde çalışma için aynı vericiden alınan hücreler türleri olması önemlidir. Ayrıca aynı doku MKH ve ECFCs türetmek için rejeneratif amaçlar için faydalı olabilir. Hücresel terapötikler sonunda Masadan yatağın başucuna kendi yolunu bulmak gerekir çünkü biz, izole etmek için yeni bir yöntem kurulmuş ve daha fazla hayvansal protein kullanmadan progenitör hücrelerin genişletmek. Pooled insan trombosit lizatı (pHPL) fetal sığır serumu tamamen xenogeneic proteinler hücreleri temas önlemek için tüm adımları protokol yerini aldı. Bu video bir göbek kordonu progenitör hücrelerin izolasyonu ve genişleme için bir metodoloji ortaya koymaktadır. Tüm malzeme ve usulleri açıklanan olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

isolation-animal-serum-free-expansion-human-umbilical-cord-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

15.3K Görüntüleme.  Medical University of Graz, Austria. Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

Video: Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biyoloji

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...