Name: megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

Yazarlar Avustralya sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (grant 1012409 BHC için bağlı proje) desteğiyle kabul etmiş oluyorsunuz.

Bu iletişim kuralı Güney Doğu Sydney insan araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve University of New South Wales insan araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Göbek Kordon kanı sağlıklı bağış elde Sydney Kordon Kanı Bankası tarafından (Sydney, NSW, Avustralya) sağlandı. Yaklaşık 100 mL hacimli bu yordam için kullanılmıştır.
Not: Sınıf II Biyogüvenlik aseptik teknik kullanılarak kabine çalışmaz. Kordon kan torbası % 70 etanol ile dış dezenfekte etmek. Steril aletlerin (makas, cımbız) için bu yordamı kullanın.
1. kordon kan hücresi hazırlık ve CD34 yalıtım+ hücreleri
<ol>
	<li>Steril ayrılık arabellek (SB) fosfat tamponlu tuz (PBS) ile pH 7.2 ve içeren % 0.5 sığır serum albümin ve 2 mM EDTA, hazır olun.</li>
	<li>SB 10 mL (bir tüp 10 mL kan başına gereklidir) 50 mL konik tüp içine dağıtmak. Bir 10 mL şırınga monte G18 künt iğne kullanarak, 10 mL kan çantasından çizmek ve SB 10 mL içeren 50 mL tüpler içine dağıtmak.</li>
	<li>Lenfosit ayrılık medya ( Tablo malzemelerigörmek) 15 mL tüp iki katman oluşturma seyreltilmiş kan içeren altýna ekleyin. Not: medya yavaş yavaş farklı katmanları karıştırma önlemek için tüp altındaki dağıtmak.</li>
	<li>Tüpler, 1200 × g (RT) oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj kapasitesi yok break ve hiç ivme ile.</li>
	<li>Aktarım katmanı içeren mononükleer hücreler (yaklaşık 5-10 mL her tüp) Pasteur pipet kullanarak yeni 50 mL tüp tüp merkezine yakın. SB her tüpün toplam hacmiyle 50 mL ekleyin.</li>
	<li>400 × g RT. atma, 10 min için de süpernatant santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Askıya alınan hücrelerin hücre topakları SB. birleştirin 5-10 ml Pasteur pipet ile dikkatli bir şekilde resuspend ve 50 mL ile SB ses getirmek.</li>
	<li>Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre kullanarak veya otomatik hücreleri hesaplama counter ( Tablo malzemelerigörmek) hücre. CD34 yüzdesini belirlemek için+ örnek, resuspend 2.5 × 105 100 µL SB ve leke hücrelerde 4 ° C'de anti-CD34-PE antikor için 15-30 dakika 10 µL ekleyerek hücreleri Akış Sitometresi (şekil 1A) tarafından analiz.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri 4 ° C'de 10 dakika için 400 × g de Süpernatant atmak. Not: Eğer değilse hemen gerekli, mononükleer hücreler bu aşamada donmuş olabilir.</li>
	<li>SB 300 µL 108 hücre başına hücrelerde resuspend. FcR insan IgG 100 µL ekleyin (Reaktif, engelleme bkz: Malzemeler tablo) ve CD34 manyetik boncuklar 108 hücre başına 100 µL. Karışımı yavaşça ve 30-40 dk 4 ° C'de kuluçkaya. Not: Bir tek hücre süspansiyon gereklidir (gerekirse, hücreleri yine de 30 µm filtre reaktifler eklemeden önce geçmek). Burada açıklanan 108 hücreler için veya daha az reaktif birimler kullanın. 10'dan fazla8 hücreler için buna göre reaktifleri (SB, çözüm ve CD34 manyetik boncuklar engelleme) ölçeklendirin.</li>
	<li>LS ayrılık sütun kuluçka döneminde LS sütun bir manyetik tutucu içinde yerleştirerek ve atık SB. atma 3 mL ile yıkama hazırlayın. Not: LS ayrılık sütunları ilâ 2 × 108 toplam hücreleri ile yüklenebilir. Küçük ve büyük sütunlar kullanılabilir.</li>
	<li>5-10 mL SB hücre karışıma ekleyin ve 10 dakika süreyle 400 × g, santrifüj süpernatant atın.</li>
	<li>Hücreleri SB 1.5 ml resuspend ve LS sütun üzerine hücre süspansiyon (1,5 mL) yükleyin. 15 mL toplama tüp (negatif kesir #1) etiketlenmemiş hücreleri içeren aracılığıyla akış toplamak. Sıvı drenaj ve sütun SB 1,5 mL ile yıkamak izin.</li>
	<li>(3 mL) ile toplanan akışı sütuna geri yüklemek ve aynı 15 mL toplama tüp (negatif kesir #1) aracılığıyla akış toplamak. LS sütun 3 kez SB 3 mL ile yıkayın. Not: gerekirse, negatif kesir (12 mL) hücrelerde CD34 yakalanması tespit etmek için anti-CD34 antikoru ile Boyanabilen+ hücreleri tarafından LS sütun.</li>
	<li>Sütun manyetik ayırıcı kaldırın ve hücrelerin yavaş yavaş şırınga lavabo pompası ile SB 2 mL ile yeni bir 15 mL tüp içine boşalt.</li>
	<li>Sütun geri manyetik ayırıcı ve yük hücreleri 2 mL sütuna yerleştirin. Aracılığıyla akış toplamak ve 2 mL SB ile yıkayın. Bu negatif kesir #2 (4 mL) olduğunu.</li>
	<li>Manyetik ayırıcı LS sütun kaldırın ve 2 mL SB. Flush hücre sürekli ve sıkıca ekleyin CD34 toplamak için enjektör pompası ile+ hücre kesir. Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Santrifüj tüpü ile 400 × g 4 ° C'de 15 dakika de olumlu kesir Süpernatant atmak. CD34 için serum-Ücretsiz medya hücrelerde resuspend+ hücreleri (SFM, Tablo malzemelerigörmek). Not: Eğer değilse hemen gerekli, hücreler sıvı azot içinde bu aşamada donmuş olabilir.</li>
</ol>
2. saflık denetimi izole CD34+ hücreleri
<ol>
	<li>Pozitif kesir 10 µL anti-CD34-PE antikor ve 20 µL anti-CD45-PerCP antikor 4 ° c (ayrı bir tüp kullanımı izotip denetimleri) 15 dakika ile 2 x 104 hücrelerden leke (şekil 1B).</li>
	<li>SB yıkamak için 1 mL ekleyin. 400 × g 10 dakika süreyle de SB 200 µL Resuspend Pelet santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Akış sitometrik çözümlemesi gerçekleştir ve enkaz (şekil 1B) dışlamak için canlı hücre nüfus kapısı. Kapıyı PE ve PerCP izotip denetimleri (şekil 1B) kullanarak PE ve PerCP olumlu nüfus için ayarla ve CD34 yüzdesini belirlemek+/CD45+ hücreleri.</li>
</ol>
3. megakaryocyte farklılaşma
<ol>
	<li>Tohum 5 × 105 hücre/mL CD34+ hücreleri iyi bir 12-şey plaka başına 50 ng/mL rekombinant insan thrombopoietin ile (rhTPO) takıma SFM 2 ml. Hücreleri 37 ° c, % 5 CO2 oksijen bir atmosferde kuluçkaya. Önce analiz için gerekli Konfluent hücrelerdir, hücreleri hasat ve birden çok wells taze medya ve rhTPO ile ayrılmıştır. Not: İki ya da üç kuyular farklılaşma farklı zaman noktalarda (örneğin, gün 7, 9 ve 10) izlemek için özel olarak hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Hücre farklılaşması hücre diğer Wells bozmadan izlemek için bir kenara kuyulardan hasat.</li>
	<li>20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antikor hücrelerle leke ve 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antikor son hacmi 100 µL. bir denetim kurmak tüp ilgili izotip kontrol antikorları kullanarak. 15-30 dk 4 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>SB yıkamak için 1 mL ekleyin.</li></ol>400 × g 10 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi ve Pelet SB. analiz 200-300 µL içinde Akış Sitometresi tarafından resuspend.
	<li>Her fluorophore için analiz etmek için FITC ve Alexa un 647 olumlu nüfus çoğunluğuna ayarlamak için izotip kontrol eder. CD41 yüzde belirlemek için lekeli hücre örnekleri analiz+/CD42a+ çift olgun MK (şekil 1 c) temsil pozitif hücrelerinin.</li>
	<li>Hücre mikroskobik görselleştirme için 3,3 içinde açıklandığı gibi hücre yüzey işaretleyicileri leke.<ol>
		<li>SB yıkamak için 1 mL ekleyin. Vasıl 400 × g 10 dakika süreyle santrifüj Resuspend Pelet 100 µL SB ve spin 1000 x g 5 dk. düzeltme hücrelerin metanol için 30 s. hava kuru, daldırma tarafından slayt üzerinde de bir cam slayt üzerine eklemek DAPI içeren medya montaj 20 µL ( Tablo malzemelerigörmek) , kapak ile coverslip ve floresan mikroskop (şekil 2A) kullanarak görselleştirmek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Görselleştirme hücre içi antijenleri için PBS hücrelerde resuspend ve paraformaldehyde (% 1 son konsantrasyonu) oda sıcaklığında 15 dakika ile düzeltin. Hücreleri permeabilize için triton-X 100 (% 0,1) ekleyin ve 2 mL içeren 15 dk. yıkama hücreler için kuluçkaya PBS/0.1% triton-X 100. PBS/0.1% triton-X 100 100 µL içinde resuspend, vWf ve anti CD62p antikorları (1: 200 seyreltme) eklemek ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.<ol>
		<li>2 mL PBS/0.1% triton-X 100 ile yıkayın ve vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi, aynı arabellek 100 µL içinde resuspend ve anti-fare IgG-Alexa 594 ve anti-tavşan IgG-Alexa 488 (1: 100) ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya, 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 ile yıkayın, aynı arabellek 100 µL içinde resuspend ve CD42b-APC anti, 20 µL ekleyin. Sonra hücreleri cam slayta 3.6.1. adımda açıklandığı gibi spin ve örnekleri mikroskobik görselleştirme için 3.6.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ploitlik belirlenmesi için günde 12-13 farklılaşma hücre hasat. SB yıkamak için 1 mL ekleyin. 10 dk ve son hacmi 100 µL. 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antikor ile leke için 400 × g, santrifüj Incubate 4 ° c 30 dk için.<ol>
		<li>Bir keresinde SB 1 mL ile yıkama ve Pelet Hipotonik sitrat arabellek (1,25 mM sodyum sitrat, 2.5 mM Sodyum Klorür, 3.5 mM dekstroz) içeren 20 µg/ml propidium iyodür ve %0,05 300 µL resuspend Triton-X 100. Işıktan korunan 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
		<li>20 µg/mL nihai bir konsantrasyon RNase ekleyin ve ışıktan korunan 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Propidium iyodür yoğunluğunu Akış Sitometresi tarafından 30.000-50.000 olaylar (şekil 2C) CD41-FITC+ nüfusunun toplayarak belirlemek.</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet sayımı, trombosit numaralandırma ve trombosit aktivasyon
<ol>
	<li>Günde 8 veya 9 farklılaşma ve tohum 1 × 104 hücreleri/kuyuda taze SFM 50 ng/mL rhTPO ile takıma 200 µL 48-şey levha, hücrelerden (Adım 3.1) hasat. 37 ° C, % 5, 5 gün boyunca kültür CO2. Not: nüsha wells Nefelometri amaçlar için tohum. Bu düşük yoğunluklu görselleştirme için gereklidir ve proplatelet-MK. Proplatelets genellikle yatak saymaya başla kültür 2 gün sonra görünen. 4 ve 5 gün tepedir.</li>
	<li>Yatak proplatelet MK tüm iyi bir ters ışık mikroskobu 10 X-20 X hedefleri kullanarak üzerinde saymak. Not: hücreleri oda sıcaklığında uzun süre tutarak büzülme proplatelet uzantıları neden olur bu yana bir ısıtmalı (37 ° C) mikroskop sahne, tercih edilir. Proplatelets MK vücuttan uzun uzantıları olarak gözlenir. Her MK birkaç proplatelet çıkıntılar olabilir. Proplatelets geliştirirken, MK gövdesi boyutu azalır.</li>
	<li>Hücre hasat ve vasıl 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. 20 µL Anti-insan CD41-FITC antikor, hücrelerle 3.3 ve 3.4 adımlarda açıklandığı gibi leke. Yatak proplatelet MK (pbMK) yüzdesini hesaplamak: pbMK (%) = [(Proplatelet taşıyan MKs/de) / (Toplam CD41+ hücreleri / de)] x 100</li>
	<li>Trombosit kültür orta serbest saymak için yavaşça hücreleri Pasteur pipet ile karıştırın ve 100 µL gün 14 veya 15 kültür toplamak.<ol>
		<li>20-30 dk 4 ° C'de 20 µL Anti-insan CD41-FITC antikor ile leke İlgili izotip kontrol antikor kullanarak bir denetim tüp kadar ayarla.</li>
		<li>SB 150 µL ve boncuk sayma 50 µL ekleyin.</li>
		<li>Akış sitometrik çözümlemesi için FSC ve SSC ölçek oturum için ayarlayın. Kullanım normal insan kan trombosit trombosit açısından zengin plazma üzerinden CD41-FITC ile trombosit (şekil 3A) geçişi ayarlamak için 4.4.1 bölümünde açıklandığı gibi lekeli.</li>
		<li>Akış Sitometresi tarafından boncuk sayma ile lekeli trombosit analiz. FSC SSC dağılım çizim (şekil 3A) karşı kullanarak boncuk sayma 1000 olayları toplamak. Formülü kullanarak CD41-FITC olumlu olayları üzerinde (şekil 3B) alan trombosit sayısını hesaplar: Trombosit µL başına = [(CD41-FITC olumlu olayların numara)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/örnekleme birimi)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trombosit aktivasyon analiz etmek için yavaşça hücreleri Pasteur pipet ile karıştırın ve 100 µL gün 14 veya 15 kültür toplamak. 1 mL Tyrode'nın arabellek (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0.2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5.5 mM D-glikoz, pH 6,5) ve santrifüj 200 x g hücreleri cips için 5 dakika için ekleyin.<ol>
		<li>Toplamak süpernatant ve santrifüj vasıl 800 x g platelet boyutlu parçacıklar cips için 10 dakika için.</li>
		<li>Süpernatant atın ve Tyrode'nın arabellek 100 µL içinde resuspend. PAC1-FITC antikor ve adenozin nükleotittir (ADP) 20 µL bir son konsantrasyon 20 µM. için eklemek FITC olumlu olaylar yüzdesini belirlemek için Incubate, oda sıcaklığında 20 dk. analiz Akış Sitometresi ile için. Pozitif kontrol (şekil 3 c) olarak aynı şekilde tedavi taze insan trombosit kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation.">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li><li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+(TPO)+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells.">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li><li>Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis:+State+of+the+Art.">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li><li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional.">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation,+transcriptional+activity+and+platelet+production.">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li><li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34+CD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage.">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells:+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution.">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li><li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+thrombocytopenia:+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro.">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li><li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia:+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count.">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li><li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells.">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li><li>Lu, S. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice.">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li><li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming.">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208 (2016).</li><li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells:+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood.">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li><li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+CD34++cells+in+cord+blood.">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).</li><li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+proplatelet+elaboration.">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).</li><li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34++cells.">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).</li><li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds.">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li><li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34+-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand.">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li><li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation,+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1/S+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation.">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li><li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+Immune+Thrombocytopenia.">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li><li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+thrombocytopenic+purpura:+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management.">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan protokol MK ve trombosit kültür göbek kordon kanı üzerinden tutarlı üretimi için uygundur. Bu hücreler MK yayılması, farklılaşma, proplatelet oluşumu ve trombosit üretim uyuşturucu veya biyolojik etkinlikler etkisi gibi çeşitli işlemler çalışma için kullanılabilir.
Çeşitli kültür medya ve sitokin kombinasyonları literatürde mevcuttur. Toplama+ kök hücre faktörü, Flt-3 ligand, IL-3 ve Il-6 destekler CD34 gibi sitokinler, hücre ço...

Yalıtım birincil insan megakaryocytes (MK) düzenli labaratuar kullanımı için yeterli sayıda burada çekirdekli hücreler1~0.01% için hesap onların düşük frekanslı kemik iliğinde nedeniyle mümkün değildir. Ex vivo genişleme ve hematopoetik kök ve belirli büyüme faktörleri varlığında progenitör hücre farklılaşması bir uygun alternatiftir. Sitokinler kök hücre faktörü (SCF; c-kit ligand) ve İnterlökin (Il) -3 ve IL-11 de dahil olmak üzere bir dizi olmuştur MKs. Thrombopoietin (TPO) üretmek için kültür sistemlerinde istihdam megakaryocytic kültürler için en etkili büyüme ve farklılaşma faktörü olduğunu ve tek başına veya diğer sitokinler, SCF ve IL-32gibi ile etkilidir. TPO kök hücre popülasyonlarının yayılması ve MKs2olgunlaşma neden üzerinde hareket edebilir.
MK üretmek trombosit proplatelets adı verilen sitoplazmik çıkıntılar üzerinden ve, içinde vivo, yaklaşık 1 x 1011 trombosit günlük trombosit sayısı 150-400 x 109/l trombosit üretim vitro sürdürmek için kurulan 1000 kadar olmasıdır -kat vivo içinde 3tahmin ediyor ve bu artış CD34 kullanarak çok sayıda kültür koşulları vermiştir daha düşük+ MK ve trombosit üretim vitrogeliştirmek için hematopoetik progenitör hücre. CD34 ilk kaynak+ MK farklılaşma için kullanılan hücre insan periferik kan4oldu. Diğer hücre kaynakları kemik iliği5,6, embriyonik kök hücre/indüklenen pluripotent kök hücreler (ESC/IPSC)7ve göbek kordon kanı (UCB)8,9,10 yer alıyor . İnsan kemik iliği CD34+ 11 ve fare lineage negatif kemik iliği hücreleri5 üretmek MK ve trombosit içinde vitro; Yine de, insan kemik iliği kullanılabilirlik eksikliği CD34 kaynağı olarak kullanılmasını sınırlar+ hücreleri. Buna ek olarak, ESC ve IPSC hücre vitro trombosit üretim için sınırsız bir kaynağı temsil eder. Trombosit üretim bu hücrelerden besleyici hücreler fare OP9 hücreleri ve daha uzun kültür süre gibi gerektirir. Trombosit koşullarda besleyici-Alerjik türetilmiş daha az işlevsel12görünmektedir. trombosit IPSC kaynaklı ondan beri onlar-ebilmek var olmak genişlemek için büyük ölçüde klinik ortamlarında kullanımı olması muhtemel. Bu işlem lentiviral-aracılı iletim transkripsiyon faktörleri ve uzun vadeli hücre kültür13gerektirir.
UCB CD34 erişilebilir bir kaynak olduğunu+ kolayca kullanılabilir hücre araştırma ayarları. TPO yalnız kordon farklılaşma teşvik kan kaynaklı CD34+ hücreleri ve bu son derece saf, olgun MKs ezelî belgili tanımlık lüzum için serum takviyesi ya da besleyici hücreler ile ortak kültür için artış verir. Diğer sitokinler SCF farklılaşma UCB CD34 dan düşebilir gibi Flt-3 ligand ve IL-11 olgunlaşmamış megakaryocytes14üretimini teşvik ederken+ , hücreleri. Bu protokolünü açıklar yüksek saf MK kültürler kordon kanı CD34+ üretim koşullarında serum içermeyen hücreler.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Culture Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Serum-free media for CD34+ cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;CD34 Isolation Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead kit ultrapure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL)</td></tr><tr><td>Sterile separation buffer (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flow Cytometry and Cell Staining Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td></tr><tr><td>PerCP mouse anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>PerCP isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Final antibody concentration 1:5 dilution.</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-Human CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody</td></tr><tr><td>Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>V450 mouse anti-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1: 20 dilution</td></tr><tr><td>V450 isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>1:20 dilution</td></tr><tr><td>PAC1-FITC antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>Anti CD62p mouse monoclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Isotype control antibody</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Counting beads</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Smaller and larger columns are also commercially available</td></tr><tr><td>MidiMACS Separator magnet</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile</td><td>In Vitro technologies</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Antifade mounting medium with DAPI</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica</td><td>DMIRB inverted microscope</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Single cell analysis software</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope software</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells

Trombosit üretim başta olmak üzere thrombopoiesis bilinen bir işlem kemik iliğinde görülür. Thrombopoiesis sırasında hematopoetik progenitör hücre ölümcül trombosit proplatelets olarak adlandırılan uzun sitoplazmik işlemlerden serbest bırakmak için ayırt megakaryocytes denilen formu trombosit öncüleri ayırt etmek. Megakaryocytes nadir hücreler kemik iliği sınırlı ve bu nedenle labaratuar kullanımı için yeterli sayıda hasat etmek zordur. Verimli üretim insan megakaryocytes, CD34 kültür tarafından elde vitro olabilir+ hücreleri uygun koşullar altında. Burada ayrıntılı protokolünü CD34 yalıtım açıklar+ hücreleri göbek kordonu kan örnekleri sıralama manyetik hücre. Serum-Alerjik koşullar altında son derece saf, olgun megakaryocytes üretmek için gerekli adımları açıklanır. Fenotipik analiz megakaryocyte farklılaşma ve proplatelet oluşumu ve trombosit üretim belirlenmesi ayrıntılarını da temin edilmektedir. Megakaryocyte farklılaşma ve/veya anti-trombosit antikorlar veya thrombopoietin mimetics gibi proplatelet oluşumu etkilemek effectors kültürlü hücrelere biyolojik işlevi incelemek için eklenebilir.

Bu iletişim kuralı son derece saf MK kültürler kablosu hazırlanması sağlayan kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 yüzdesi+ hücreleri kablosunu prize kan mı yaklaşık %1,315 (şekil 1A) ve mononükleer hücreler (Adım 1.8) Aralık 90-300 x 10'dan toplam sayısı6 UCB birim başına. CD34 saflığı +/ hücreleri CD45 + 90 yalıtım aralığından % 99 (şekil 1B)...

Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocytes son derece saf bir nüfusa kablosunu elde edilebilir kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 için bir yöntem+ hücre izolasyon ve megakaryocyte farklılaşması burada açıklanmıştır.

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

19.5K Görüntüleme.  University of New South Wales. Megakaryocytes son derece saf bir nüfusa kablosunu elde edilebilir kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 için bir yöntem+ hücre izolasyon ve megakaryocyte farklılaşması burada açıklanmıştır.

Video: Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine induced differentiation of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineage cells. CD34+ cells are isolated from human umbilical cord blood and co-cultured with MS-5 stromal cells in the presence of cytokines. Immunophenotypic characterization of the stem and progenitor cells, and the differentiated myeloid lineage cells are described. Using this protocol, CD34+ cells may be incubated with small molecules or transduced with lentiviruses to express myeloid disease mutations to investigate their impact on myeloid differentiation.

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Here, we present a protocol for immunophenotypic characterization and cytokine induced differentiation of cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineages. The applications of this protocol include investigations on the effect of myeloid disease mutations or small molecules on myeloid differentiation of the CD34+ cells.

İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Biyoloji

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing platelets allows an in-depth study of the mechanisms underlying platelet biogenesis. Available culture protocols are mostly based on hematopoietic progenitors derived from bone marrow or cord blood raising a number of ethical, technical, and economic concerns. If there are already available protocols for obtaining CD34 cells from peripheral blood, this manuscript proposes a straightforward and optimized protocol for obtaining CD34+ cells from leukodepletion filters readily available in blood centers. These cells are isolated from leukodepletion filters used in the preparation of blood transfusion products, corresponding to eight blood donations. These filters are meant to be discarded. A detailed procedure to collect hematopoietic progenitors identified as CD34+ cells from these filters is described. The method to obtain mature megakaryocytes extending proplatelets while discussing their phenotypic evolution is also detailed. Finally, the protocol present a calibrated pipetting method, to efficiently release platelets that are morphologically and functionally similar to native ones. This protocol can serve as a basis for evaluating pharmacological compounds acting at various steps of the process to dissect the underlying mechanisms and approach the in vivo platelet yields.

This protocol describes in detail all the steps involved in obtaining leukofilter-derived CD34+ hematopoietic progenitors and their in vitro differentiation and maturation into proplatelet-bearing megakaryocytes that are able to release platelets in the culture medium. This procedure is useful for in-depth analysis of cellular and molecular mechanisms controlling megakaryopoiesis.

Megakaryosit Farklılaşması ve Trombosit Oluşumunu İncelemek için Hücre Kaynağı Olarak Leukodepletion Filtreleri-Türetilmiş CD34+ Hücreler

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.

İnsan Birincil Kaynaklarından veya Hematopoetik Progenitörlerden Farklılaştırılmış In Vitro'dan İnsan MK'larının İmmünofenoping ve Hücre Sıralama

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Kordon Kanı ve Kemik İliğinden HSPC'ler Kullanılarak Eritropoezin Modellenmesi

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 billion cells per day), is crucial for maintaining individual health. Any disruption in this pathway can have significant consequences, leading to health issues. According to the World Health Organization, an estimated 25% of the global population presents symptoms of anemia. This protocol describes how to generate human erythroid cells both in vitro using hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from sources such as umbilical cord blood (UCB) or blood taken from healthy donors and ex vivo with HSPCs isolated from patients' bone marrow. Using genetic approach, genes of interest can be modulated in HSPCs, and their impact on erythropoiesis can be monitored at various stages of the differentiation process. This method allows for the screening of compounds perturbing, enhancing, or rescuing the capacity of HSPCs to differentiate into mature erythroid cells and to investigate the role of genes of interest during the erythroid differentiation process.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: Eritropoez Araştırmalarını İlerletmek - Miyelodisplastik Sendromlarda Hematopoietik Kök Hücre Fonksiyonunu Değerlendirmek İçin Basitleştirilmiş Bir

Modeling erythropoiesis provides a valuable chance to comprehend the biological significance of actors in this process and to evaluate novel therapeutic approaches that may alleviate differentiation defects. Here, we describe a simple and reliable method to efficiently differentiate CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells ex vivo.

İnsan Eritropoezinin Etkinliğini Değerlendirmek için Kapsamlı Bir Boru Hattı İn Vitro ve Ex Vivo

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 ...

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan⁺ hücreleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Klinik Uygulama

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması⁺ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Megakaryosit Farklılaşması ve Trombosit Oluşumunu İncelemek için Hücre Kaynağı Olarak Leukodepletion Filtreleri-Türetilmiş CD34+ Hücreler

İnsan Birincil Kaynaklarından veya Hematopoetik Progenitörlerden Farklılaştırılmış In Vitro'dan İnsan MK'larının İmmünofenoping ve Hücre Sıralama

İnsan Eritropoezinin Etkinliğini Değerlendirmek için Kapsamlı Bir Boru Hattı İn Vitro ve Ex Vivo

İnsan Eritropoezinin Etkinliğini Değerlendirmek için Kapsamlı Bir Boru Hattı İn Vitro ve Ex Vivo