このプロトコルは、単一のT細胞および固体粒子を用いてAFM片持ち体を機能させる最善の方法を説明する。これらのヒントは、単一対樹状細胞-T細胞相互作用をプローブし、それぞれ気まぐれなサイズの細胞応答を監視するために使用することができます。この技術の主な利点は、カンチレバーの単一のT細胞の官能化のために生体適合性接着剤を使用することです。
この接着剤は真核細胞に不活性であり、T細胞をベースライン活性化段階に保ちます。これらの方法は、免疫細胞活性化および免疫シナプス形成などの複雑な細胞間事象に関する洞察を提供する。この方法は、細胞細胞または細胞表面相互作用を含む他のシステムにも拡張できます。
この技術に新しい人のために、T細胞が使用前に良好な状態にあり、それらが一晩IL-2で前処理されていることを確認することが重要です。また、生体適合性接着剤を使用する場合は、不要な酸化から保護するために迅速に移動します。この手順を開始するには、テキストプロトコルに従って、単一のTセルを顕微鏡用に準備します。
次に、DC2.4細胞を播種したガラスカバーリップを調製し、加湿チャンバーで一晩37°Cおよび5%CO2で細胞をインキュベートする。ピラニア処理、プラズマ洗浄、またはUVオゾン洗浄を使用して、低いばね定数で柔らかくてチップのない片持ち器を洗浄します。次に、洗浄したカンチレバーをAFMスキャンヘッドに取り付ける。
次に、きれいなサンプルチャンバーを準備し、純水でそれを満たします。まずガラス基板上で力曲線を走らせ、カンチレバーの感度を得ることによって水溶液中のカンチレバーを較正する。次に、熱ノイズスペクトルを記録して、ばね定数を抽出します。
カンチレバーが正しく調整されたら、AFMスキャンヘッドを溶液から取り外します。取り付けられた片持ちレバーを数滴の純粋なエタノールで洗い、カンチレバーをスキャンヘッドで乾燥させます。5%CO2で生きている細胞環境エンクロージャを摂氏37度に予熱します。
次に、DC2.4細胞を播種したガラスカバースリップをサンプルチャンバアセンブリに取り付け、すぐに600マイクロリットルのミディアムBをチャンバーに加えます。完成したアセンブリを AFM サンプル ステージに配置します。ヒトIL-2インキュベートCD4陽性T細胞をサンプルチャンバーに加えます。
ターゲットT細胞がカバースリップの底に完全に落ち着くまで待ってから、顕微鏡下の視野に細胞を持ち込みます。今、ピペットで取り付けられたカンチレバーの端に生体適合性接着剤の2マイクロリットルの滴を追加します。カンチレバーに生体適合性の接着剤を塗布したら、密着性を最大限に高めるためには、その後のステップをできるだけ早く仕上げな必要があります。
スキャニングヘッドをサンプルステージに素早く置き、接着剤でコーティングされたカンチレバーを溶液に浸します。健康 T 細胞が片持ち面の先端の下に位置するまでサンプル ステージを移動します。次に、走査ヘッドを動かして位置を細かく調整する。
次に、手動でカンチレバーを下げます。50ミクロンのステップサイズから始まり、カンチレバー画像の鮮明さによって示されるように、10、5、2、そして最後に0.5ミクロンに徐々に減少します。ステッパーモーターの位置を保持し、カンチレバー先端とセルをより良く整列させるためにスキャンヘッドの位置を調整します。
確固たる接触が、0.5~1.5ナノニュートンの典型的な力に対応する、レーザーの位置の小さな変位によって示されるまで続けます。30秒接触した後、片持ちレバーを引き込む。セルがカンチレバーと一緒に移動すると、アタッチが成功しました。
それ以外の場合は、新しいカンチレバーに切り替える前に、接着ステップを最大3回繰り返します。付属のTセルをDC2.4セルの上に置き、サンプルステージとスキャンヘッドを移動します。適切なパラメータを設定した後、サンプル上で力分光法を実行します。
新しい調査ラウンドのために、新しい、きれいな片持ち面を取り付ける。純水で較正し、T細胞樹状細胞ペアに戻り、スキャンを繰り返します。洗浄したガラスカバースリップをサンプルチャンバアセンブリに取り付けます。
カバースリップの左側に、エタノールで希釈し、直径6ミクロンのポリスチレンビーズを含むビーズ溶液の滴を加えます。溶剤が蒸発したら、20倍の目的を備えた明視野顕微鏡を使用してビーズの間隔を確認します。個々のビーズが十分に分離されていることを確認します。
次に、マイクロピペットチップまたはつまようじをよく混合したエポキシ接着剤に浸し、ここで示すように、右側に連続した穏やかなタッチで3つの別々のスポットに少量の接着剤を移します。次に、洗浄されたチップレスの片持ちをAFMスキャンヘッドに取り付け、クリーンな表面で空気中で較正し、ばね定数を得ます。次に、最後のエポキシ接着剤スポットの左側の境界上に片持ち線先を配置し、ステッパーモーターの小さなステップサイズを使用して、カンチレバーを接着剤の近くにゆっくりと持って来ます。
接着剤と接触したら、AFMスキャンヘッドを後方に動かして片持ちを横に素早く引っ張ります。余分な接着剤をガラスにこすり落とし、先端の一番端に少量の接着剤しか残さずに取り除きます。さて、よく隔離されたビーズの上に片持ちの先端を動かします。
ゆっくりと単一のビーズにアプローチし、約10秒間2〜5ナノニュートンの範囲でそれにしっかりと接触します。接触を行う際に、細かい先端調整を使用して、先端の一番の端にビーズを配置します。接点の端にある先端を引き込む。
ビードが元の焦点面から消えた場合、着付けイベントが正常に行われます。最後に、ビーズを変えたカンチレバーを慎重に取り外し、エポキシが完全に治癒するために一晩片持ち箱に保管します。ここでは、1つのアプローチリトラクトサイクルの過程で、単一のT細胞と単一樹状細胞との結合相互作用からの典型的な力距離曲線を示します。
明るい赤い曲線は延長曲線で、濃い赤色のカーブは引き込みカーブです。曲線の最小値は、T細胞と樹状細胞の間の最大接着力の尺度を示し、曲線の下の領域はそれらを分離するために必要な作業を表します。鋭利で段階的な破裂事象は、細胞界面での強い結合のために膜テザーが細胞表面から引き出され、連続引き下げ下で離散的に破壊されると解釈することができる。
ここで、樹状細胞に結合する従来のT細胞は灰色で示され、樹状細胞に結合する制御性T細胞は青色で示されている。従来のT細胞と制御性T細胞との間の接着力は、抗原提示細胞によって提示されるペプチド抗原を認識し、一方、制御性T細胞は、免疫反応の終わりに向かって従来のT細胞媒介性免疫を遮断する抑制T細胞である。この蛍光標識された貪食性RAW264.7細胞の模式図は、単一の裸の6ミクロンの直径、ポリスチレンビーズで接近している細胞を示している。
ビーズを係合すると、膜PIP2は接触部位、b近くでソートされ、その後、モエシンの膜動員を誘導し、貪食事象をもたらす。ここで説明する手順に加えて、AFMベースの単一細胞力分光法を蛍光イメージングと併用して、単一細胞レベルでリアルタイムで免疫細胞活性化を研究することができる。蛍光技術を組み合わせることで、樹状細胞とT細胞対の間に免疫シナプスを形成するなど、より複雑な細胞プロセスにリアルタイムで対処することを可能にする。
