Questo protocollo descrive il modo migliore per funzionalizzare i cantilever AFM utilizzando singole cellule T e particelle solide. Questi suggerimenti possono quindi essere usati per sondare le interazioni cellule dendritiche-T a coppia singola e per monitorare le risposte cellulari di dimensioni volubili, rispettivamente. Un vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza una colla biocompatibile per la funzionalizzazione a singola cellula T di cantilevers.
Questa colla è inerte alle cellule eucariotiche, mantenendo così le cellule T nella loro fase di attivazione di base. Questi metodi forniscono informazioni sull'attivazione delle cellule immunitarie e su eventi intercellulari complessi, come la formazione di sinapsi immunitaria. I metodi possono anche essere estesi ad altri sistemi che coinvolgono interazioni cellula-cellula o cellula-superficie.
Per qualcuno che è nuovo a questa tecnica, è importante assicurarsi che le cellule T siano in buone condizioni prima dell'uso e che siano pretrattate con IL-2 durante la notte. Inoltre, quando si utilizza la colla biocompatibile, muoversi rapidamente per proteggerla da ossidazioni non necessarie. Per iniziare questa procedura, preparare le singole celle T per la microscopia seguendo il protocollo di testo.
Quindi, preparare le copertine di vetro sementi con cellule DC2.4 e incubare le cellule durante la notte in una camera umidificata a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Pulire i cantilever morbidi e senza punta con una costante a bassa molla utilizzando il trattamento piranha, la pulizia del plasma o la pulizia UV-ozono. Quindi, montare la sbalziera pulita sulla testina di scansione AFM.
Quindi, preparare una camera campione pulita e riempirla con acqua pura. Calibrare il sbalzino nella soluzione d'acqua eseguendo prima una curva di forza sul substrato di vetro per ottenere la sensibilità del sbalzino. Quindi, registrare uno spettro di rumore termico per estrarre la costante di molla.
Quando il cantilever è calibrato correttamente, rimuovere la testina di scansione AFM dalla soluzione. Lavare la sbalziera montata con alcune gocce di etanolo puro e mantenere la sbalziera asciutta sulla testa di scansione. Preriscaldare un involucro dell'ambiente cellulare vivente a 37 gradi Celsius con il 5%CO2.
Quindi, montare il coperchio di vetro seminato con celle DC2.4 all'assemblaggio della camera campione e aggiungere immediatamente 600 microlitri di Medio B alla camera. Posizionare l'assieme completato nella fase campione AFM. Aggiungere cellule T positive cd4 incubate dall'IL-2 umano nella camera campione.
Attendere che le celle T di destinazione siano completamente sistemate sul fondo del coverslip, quindi portare le cellule nel campo visivo al microscopio. Ora, aggiungere una goccia a due microliter di colla biocompatibile all'estremità del sbalzino montato con una pipetta. Una volta che la colla biocompatibile è stata applicata al sbalzino, i passaggi successivi devono essere completati il prima possibile al fine di massimizzare l'adesione.
Posizionare rapidamente la testa di scansione sullo stadio del campione, immergendo la sbalziera rivestita di colla nella soluzione. Spostare lo stadio del campione fino a quando una cellula T di salute non si trova sotto la punta del cantilever. Quindi, regolare finemente la sua posizione spostando la testa di scansione.
Quindi, abbassare manualmente la sbalziola. Iniziare con una dimensione del passo di 50 micron, quindi diminuire a 10, cinque e due e infine 0,5 micron gradualmente, come indicato dalla nitidezza dell'immagine a sbalzi. Ora, tenere la posizione dei motori stepper e regolare il posizionamento della testa di scansione per allineare meglio la punta a sbalzi e la cella.
Continuare fino a quando il contatto fermo è indicato da un piccolo spostamento della posizione del laser, corrispondente a una forza tipica da 0,5 a 1,5 nanonewton. Dopo 30 secondi di contatto, ritrarre la sbalziola. Se la cella si sposta con il sbalzino, l'attacco ha avuto esito positivo.
In caso meno, ripetere il passaggio di adesione fino a tre volte prima di passare a un nuovo sbalzino. Posizionare la cella T attaccata sopra una cella DC2.4 spostando lo stadio del campione e la testa di scansione. Dopo aver impostazione dei parametri appropriati, eseguire la spettroscopia di forza sul campione.
Per un nuovo ciclo di sondaggio, montare un nuovo sbalzino pulito. Calibrarlo in acqua pura, quindi tornare a una coppia di cellule dendritiche a T e ripetere la scansione. Montare un coperchio di vetro pulito sull'assieme della camera campione.
Sul lato sinistro del coverslip, aggiungere una goccia di una soluzione di perline che è stata diluita in etanolo e contiene perline di polistirolo di sei micron di diametro. Una volta che il solvente evapora, controllare la spaziatura delle perline utilizzando un microscopio a campo luminoso dotato di un obiettivo 20x. Assicurarsi che le singole perline siano ben separate.
Quindi, immergere una punta di micropipetta o uno stuzzicadenti in una colla epossidica ben miscelata e trasferire una piccola quantità di colla in tre punti separati con successivi tocchi delicati sul lato destro ma vicino al centro del coverslip, come mostrato qui. Quindi, montare un sbalzino pulito e senza punta sulla testina di scansione AFM e calibrarlo in aria con una superficie pulita per ottenere la costante di molla. Quindi, posizionare la punta a sbalzi sul bordo sinistro dell'ultimo punto di colla epossidica e portare lentamente il sbalzino vicino alla colla utilizzando piccole dimensioni dei gradini sui motori stepper.
Una volta effettuato il contatto con la colla, tirare rapidamente la sbalziera lateralmente spostando la testa di scansione AFM all'indietro. Rimuovere la colla in eccesso strofinandola contro il vetro, lasciando solo una piccola quantità di colla all'estremità della punta. Ora, sposta la punta a sbalzi sulla parte superiore di una perla ben isolata.
Avvicinati lentamente al singolo tallone e fai un contatto fermo con esso nell'intervallo da due a cinque nanonewton per circa 10 secondi. Durante il contatto, utilizzare la regolazione della punta fine per posizionare il tallone all'estremità della punta. Ritrarre la punta alla fine del contatto.
Se la perla scompare dal piano focale originale, si è verificato un evento di adesione riuscito. Infine, smontare accuratamente il sbalzino modificato perline e conservarlo in una scatola a sbalzi durante la notte affinché l'epossidico possa polimerizzare completamente. Ecco le tipiche curve forza-distanza dall'interazione di legame tra una singola cella T e una singola cella dendritica nel corso di un ciclo di avvicinamento-retrazione.
La curva rosso chiaro è la curva di estensione, e quella rosso scuro è la curva di retrazione. Il valore minimo nella curva fornisce una misura della forza massima di adesione tra la cella T e la cella dendritica, e l'area sotto la curva rappresenta il lavoro necessario per separarli. Gli eventi di rottura taglienti e stepwise possono essere interpretati come tether di membrana estratti dalla superficie cellulare a causa del forte legame all'interfaccia cella-cella e quindi rotto discretamente sotto la trazione continua.
Qui, il legame convenzionale delle cellule T alle cellule dendritiche è mostrato in grigio e il legame normativo delle cellule T alle cellule dendritiche è mostrato in blu. Le forze di adesione tra una cellula T convenzionale e una cellula T regolatoria riconoscono gli antigeni peptidici presentati dalle cellule che presentano antigeni, mentre le cellule T regolatorie sono cellule T soppressori che arresta l'immunità convenzionale mediata dalle cellule T verso la fine di una reazione immunitaria. Questo schema di una cella RAW264.7 fagocitica etichettata fluorescentmente mostra la cellula che viene avvicinata con un singolo perline di polistirolo nudo di sei micron di diametro.
Al momento del coinvolgimento del tallone, la membrana PIP2 viene ordinata nel sito di contatto, vicino a b, il che induce quindi il reclutamento a membrana della moesina, con conseguente evento fagocitico. Oltre alla procedura qui descritta, la spettroscopia di forza a singola cellula basata su AFM può essere utilizzata insieme all'imaging a fluorescenza per studiare l'attivazione delle cellule immunitarie in tempo reale a livello di singola cellula. Tecniche combinate di fluorescenza, questo metodo consente di affrontare processi cellulari più complessi in tempo reale, come la formazione di una sinapsi immunitaria tra la cellula dendritica e la coppia di cellule T.
