RNA tabanlı luciferase testi nin transkripsiyonu için protokolümüz, çiçek virüsü enfekte hücrelerde çeviri regülasyonunun incelenmesine yardımcı olur. Ayrıca, Poly (A) litre özelleştirilmiş bir uzunluk çeviri üzerindeki düzenleyici etkileri incelenmesine olanak sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, mRNA'da 5'UTR ve 3'UTR gibi Cis elemanları tarafından çeviri düzenlemesinin incelenmesine ve geniş çeviri başlatma spektrumuna olanak sağlamasıdır.
In vitro transkripsiyonlu RNA tabanlı luciferase muhabir testi, kap ve diğer modifikasyonlara değişiklik yapmak üzere uyarlanmış ve çeviri üzerindeki etkisini test etmek için kullanılabilir. Başlamak için, 5'to 3'yönünde aşağıdaki öğeleri içeren PCR amplicon oluşturmak için ileri ve geri astar tasarımı:T7-Promoter, Poly(A)litre, Firefly Luciferase ORF bir Poly (A) kuyruk T7_12A-Fluc olarak anılacaktır, ileri astar birkaç ekstra nükleotitler t7-Promoter Poly (A)litre veya istenen 5'UTR dizisi ve yaklaşık 20 nükleotit muhabir genin ORF 5'sonuna karşılık gelen takip içerir. Astar uzunluğunu, muhabir genin ORF'sinin 5'sonuna karşılık gelen erime sıcaklığına göre ayarlayın ve astardaki ilgili bölgenin genin duyu iplikçiği ile aynı olmasını sağlar.
Daha sonra Poly(A) kuyruğu nuve yaklaşık 20 nükleotit içerecek şekilde ters astar tasarlayın. Muhabir genin ORF'sinin 3'ucuna karşılık gelen erime sıcaklığına göre ayarlayın, astarın ilgili bölgesinin genin antisense iplikçiği ile aynı olmasını ve Poli(A) kuyruğundan önce çerçeve içi durdurma kodonunun bulunmasını sağlar. İç kontrol için, 5'to 3'yönünde aşağıdaki öğeleri içeren başka bir astar kümesi tasarlayabilirsiniz: T7-Promoter, Kozak dizisini içeren rastgele bir 5'UTR kodlama dizisi, Renilla Luciferase ORF ve T7_Kozak-Rluc olarak adlandırılan Poli(A)kuyruk.
Reaksiyonu ayarlamak için, bir PCR tüpüne aşağıdaki sırayla reaktifler ekleyin:DNase serbest su, 2Kat yüksek sadakatli DNA polimeraz, astar lar ve dizi onaylı luciferase şablonu DNA'sına. Bir DNA şablonu oluşturmak için standart bir üç adımpcr döngüsünden sonra, pcr reaksiyonunun %5-10'unu moleküler ağırlık standardı ile birlikte %1 agarose TAE jel elektroforezinde çalıştırarak PCR ürününü tespit edin. PCR ürününün boyutunu belirlemek için jeli uv aydınlatıcının altında görselleştirin.
PCR ürünün doğru boyutunu belirledikten sonra, DNA'yı eleştirmek için 100 mikrolitre nükleaz içermeyen su kullanarak ticari olarak kullanılabilen PCR arıtma kitini kullanarak arındırın. Saflaştırılmış DNA konsantrasyonuna bir spektrofotometre kullanarak kontrol edin ve in vitro transkripsiyon için hemen kullanılmak üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın. PCR ürününden RNA sentezlemek için aşağıdaki reaktifleri mikrosantrifüj tüpüne ekleyin:DNase-RNase serbest su, NTP tampon karışımı, kapak analogu, PCR ürün şablonu ve in vitro transkripsiyon kitinden T7-RNA polimeraz karışımı.
Iyice karıştırın. İki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatve sonra bir RNA arıtma kiti kullanarak sentezlenen RNA'nın saflaştırılmasına devam edin. Saflaştırılmış RNA kontrol etmek için, ısı RNA beş dakika ikincil yapısı kaldırmak ve 1.5 agarose TBE jel üzerinde çalıştırmak için.
Sonra bir UV aydınlatıcı altında jel görselleştirin. Bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış RNA konsantrasyonu kontrol edin. Aliquot ve eksi 80 santigrat derece de saklayın.
Tohum HeLa hücreleri 24 iyi plaka içinde% 80-90 birleştiği gün elde etmek ve bir gece boyunca bir kuvöz de 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile kuluçka. Beş enfeksiyon çokluğu ile Vaccinia virüsü ile HeLa hücreleri enfekte ve karşılaştırma için enfekte olmayan HeLa hücreleri tutun. Sonra 10 ila 12 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece plaka kuluçka.
Enfeksiyon sonrası istenilen saatlerden sonra, Firefly Luciferase mRNA taşıyan 12A dizisinin 480 nanogramını ve Renilla Luciferase mRNA'yı taşıyan 20 nanogram Kozak dizisini bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın. Başka bir mikrosantrifüj tüpünde, katyonik lipid transfeksiyon reaktifi 1.1 mikrolitre ekleyin. Her iki tüpe de 55 mikrolitre azaltılmış serum media ekleyin, oda sıcaklığında beş dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
Daha sonra 55 mikrolitre katyonik lipid transfeksiyon reaktifi içeren azaltılmış serum media içeren mRNA içeren tüp ekleyin. Hafifçe ama iyice bir pipet ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka ile karıştırın. Kuluçka sırasında, hücrelerden hücre kültürü ortamı kaldırmak ve iyi başına azaltılmış serum orta 400 mikrolitre ekleyin.
Kuluçka tamamlandığında, karışım damla akıllıca ve 24 iyi plaka kuyu başına eşit 100 mikrolitre ekleyin. 12A Fluc ve Kozak Rluc mRNA ile beş saat sonra co-transfection, hücrelerden azaltılmış serum ortamı kaldırmak ve iki muhabir tahlilleri gerçekleştirme yeteneğine sahip Luciferase tahlil kiti 150 mikrolitre 1X lysis tampon ekleyerek hücreleri lyse. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkadan sonra, kauçuk ve steril şırınga kullanarak hücreleri kazıyın ve mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Hücre enkazını püskürtmek için, 12,000 kez g'de 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca lysat'ı santrifüj edin. Opak duvarlı 96 iyi beyaz bir deneme plakası ve sağlam bir alt ile kuyu başına supernatant 30 mikrolitre aktarın. El yazmasında açıklandığı gibi kinetik işlevini kullanarak çift Parlaklığı ölçmek için Luciferase tsay kitini ve çok modlu plaka okuyucu luminometresini kullanın.
Luminescence okuma verilerini istenilen dosya biçimine dışa aktardıktan sonra, enfekte olmamış ve VACV enfekte HeLA hücrelerinde 12A Fluc mRNA'dan gelen göreli çeviri oranını, Fluc değerini iç kontrol Rluc değerine bölerek belirleyin. Bu test, enfekte olmayan ve VACV enfekte hücrelerde 5'Poly(A)litre içeren bir Fluc mRNA'nın çeviri verimliliğini test etmek için kullanılmıştır. Hem enfekte olmayan hem de VACV enfekte hücreler Fluc ve Rluc mRNA ile başarılı bir şekilde transfeced edildi.
Fluc'un Rluc tarafından bölünmesi, hücrelerdeki RNA stabilitede transfeksiyon verimliliğini normalleştirdi. 5'Poly(A)litre mRNA içeren enfekte olmayan hücrelere göre VACV enfeksiyonu sırasında çevirisel bir avantaja sahiptir. RNA düzeyi enfekte olmayan ve VACV enfekte hücrelerde mRNA transfeksiyonundan beş saat sonra benzer olduğu için bu durum diferansiyel transfeksiyon verimi veya mRNA stabilitesine bağlı değildi.
Bu sadece PCR reaksiyon verimliliğini değil, aynı zamanda güçlendirilmiş DNA gerektiren tüm downstream süreçleri etkileyebilir gibi astar tasarlarken özel dikkat edin. Bu yöntem, cis elemanları tarafından çeviri düzenlemesini hızlı bir şekilde test etmek için önemli bir testtir. Mümkünse, bu yöntem diğer tamamlayıcı deneyler le doğrulanmalıdır.
Vaccinia virüsü kullanılırken önlem alınmalı ve ethidium bromür ve fenol gibi kimyasallara maruz kalmaktan kaçınılmalıdır.
