Biz ST-246 sağlamak için SIGA Teknolojileri (Corvallis, OR) teşekkür ederim. DKR Boston Üniversitesi (5T32AI 7309) için immünoloji bir NIH eğitim bursu ile desteklenmiştir. Bu çalışma P41 086180 tarafından kısmen desteklenen, NIH RO1AI1096159-01, ve RO3&#39;ü (JHC için).

1.. Plaka Hücreler <ol><li> Plakasından HeLa hücreleri ayırmak ve yaklaşık olarak 2.0 x 10 5 hücre / ml büyüme ortamı (DMEM, 2 mM L-fazlalığı,% 10 FBS) içerisinde seyreltin. , Siyah duvarlı, şeffaf, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın (20,000 hücre / oyuk) içinde 100 ul / oyuk dağıtın. </li><li> +% 5 CO2 37 ° C kuluçka makinesi içinde birleşene kadar 24 saat boyunca inkübe hücreleri. </li></ol> 2.. Hücreleri enfekte <ol><li> Virüs sulandırmak ve hücreleri enfekte. <ol><li> Çözülme TRPV (Triple virüsü; Erken Venüs, Orta MCherry, Geç TagBFP) ve PLV (Promotörle az Venüs) floresan virüs ve 5 dakika boyunca Sonikasyon kullanarak ayrıştırılacaktır. Seçenek olarak ise, ham virüs stokları enfeksiyonu ortam içinde 0.25 mg / ml tripsin ile 1:1 karıştırıldı ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilebilir. </li><li> 37 ° C enfeksiyon ortamı (DMEM, 2 mM L-fazlalığı,% 2 FBS) içinde, ham virüs stokları seyreltin. Yüksek İçişleri Bakanlığı enfeksiyonları (10 PFU / hücre) için, PFU / ml 5 x 10 4 varsayarak 1,0 x 10 7 virüs stok sulandırmakiyi hücre / 50 ul bir inokulum hacmi. TRPV her tedavi ve her bir tedaviye özel eşiğe hesaba PLV ile aynı tedavi için bir başka 3 suret kuyu boyunca 3 suret kuyu enfekte planı. </li><li> Enfeksiyon ortam içinde 50 ul / göz miktarında seyreltilmiş virüs eklenerek kuyu Infect. Bu sefer = 0 saat sonrası enfeksiyon (0 HPI) olarak tanımlanır. </li></ol></li><li> Enfeksiyon ortamı içine arzu edilen tedavi bileşikleri seyreltin. Tüm tedaviler için tek bir ana karışım 2x seyreltme yapılmış ve kuyu (50 ul, her altı 96-kuyu için, örneğin 350 ul toplam hacim) çoğaltmak için uygulanmalıdır. <ol><li> Enfeksiyon ortama deney bileşikleri seyreltin. </li><li> Enfeksiyon ortama araç kontrol çözücü (örneğin, PBS, DMSO) seyreltin. Not: Deney bileşikleri (örneğin başvurusunda olarak IBT stok DMSO ile yapılır ve nihai concentratio kullanılır ise araç kontrol çözücülerin benzer nihai konsantrasyonlar kullanılmalıdır1 ul ns / ml, daha sonra araç kontrolü olarak 1 ul / ml), tek başına DMSO kullanın. </li><li> Enfeksiyon ortama kontrol bileşikleri sulandırmak. Tavsiye edilen kontrol bileşikler şunlardır: 3.6 uM (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosilsitosinin (AraC), 50 uM (11.7 ug / ml) isatin β-tiyosemikarbazon (IBT), 60 uM (50 ug / ml) Rifampisin, ya da 5 uM (1.9 ug / ml) ST-246 8,15,16. Beklenen etkileri Temsilcisi Sonuçları gör. Not: Bu da zaten birime bir 01:01 oranında ilave edilir Başlangıcı iki kez (2x) ile istenen son konsantrasyona bu seyreltme olun. </li></ol></li><li> Hemen virüs ilave edildikten sonra, aşama 2.2 &#39;de inceltilmiş olarak arzu edilen tedavi ve kontroller içeren 50 ul enfeksiyon ortamı eklenir. Not: Erken evre ifade önce engellenmesi için tahlil edilmesi için, bileşik (ler) ya da seyreltilmiş virüs aşı (aşama 2.1.2) doğrudan ilave edilebilir veya (aşama 2.1.3 önce), enfeksiyondan önce konakçı hücreler için. </li><li> 37 ve # 6-24 saat inkübe176; C inkübatör +% 5 CO 2. </li></ol> 3.. Hücreleri Fix <ol><li> De daha önce her bir enfeksiyon ortam için 100 ul% 8 paraformaldehit ekleyerek, hücreler. Işıksız bir ortamda 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Not: Bu yüksek titre medya öncesinde tespit atık çanak doğrudan ters çevrilir ise oluşabilir bulaşıcı ineklerdeki aerosolizasyonu önlemek için doğrudan enfeksiyon medyaya 2x PFA (% 8) eklemek için önerilir. </li><li> Atık çanak içine plakayı baş aşağı çevirerek Fiksatif çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığı PBS 100 ul ekleyin. </li><li> Optik olarak berrak yapışkan film ile plaka mühür. Not: hemen okuyun değilse Plakalar, 4 ° C&#39;de saklanabilir. Spektrofotometre ölçümleri bozan yoğunlaşmayı önlemek için okumadan önce oda sıcaklığına mühürlü plakaları dönmek emin olun. </li></ol> 4. Virüs Büyüme belirlememize <ol><li> Son nokta mCherry için Venüs, 587:610 için 515:530 de floresan ve 415:457 f ölçünveya TagBFP (Uyarım: nm emisyon dalga boyu). Dört ölçümleri, her bir kanal için optimize edilmiş kazanç ayarları kullanarak oyuk başına ortalaması alınmalıdır. Not: Uygun emisyon dalga plaka okuyucu özel model ve filtre özelliklerine bağlı olarak farklı olabilir. Bu, her bir kanal için TRPV ve PLV arasındaki en büyük fark yoktur noktayı belirlemek için bir emisyon dalga boyu tarama yaparak ampirik bir şekilde tespit edilebilir. </li><li> Deneyler arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için ham veri normalleştirmek. <ol><li> Her bir kanal için, suret TRPV ve PLV kuyu ortalamasını belirler. </li><li> Her tedavi için ortalama TRPV enfekte deneysel ölçümlerden elde edilen ortalama PLV enfekte arka ölçümleri çıkarın. </li><li> De sadece araç verilen değer, her arka plan çıkarıldı değerine bölünerek verileri normalleştirir. </li><li> Bir deney birden çok kez, varyans tek yönlü analizi (tek yönlü ANOVA) testi ve çoklu c tekrarlanan edildikten sonraomparison sonrası test tedavilerinin herhangi her kanal için sadece araç tedavisinden istatistiksel olarak önemli bir fark olup olmadığını belirlemek için yansıtmaktadır gerçekleştirilebilir. </li></ol></li></ol> . Alternatif 5 Protokol: Kinetik Plate Tahliller <ol><li> Tedavilerin eklenmesi ile tüm adımları uygulayın (2.3 adım). </li><li> Plaka okuyucu odası içinde yapıştırıcı film ve yer ile mühür levhası 37 ° C&#39;ye dengelenmiş Not: Özel bakım aşırı hücre stres ve yoğunlaşmayı önlemek için 37 ° C&#39;de sürekli plakaları tutmak için alınmalıdır. Kinetik analizi için,% 5 CO2 ilave olmadan uygun pH değerini muhafaza edilmesi için bir tamponlanmış ortam (sodyum bikarbonat ve HEPES) kullanmak için özellikle önemlidir. </li><li> Set plaka okuyucu sonra zaman noktalarında doymasını önlemek için el ele. Not: Doğru kazanç optimizasyonu benzer koşullar altında bir uç nokta tahlilleri gerçekleştirilerek elde edilebilir. </li><li> 8-24 HPI saatlik okumalar Edinme Simi kullanarak normalizeuç nokta deneyi gibi lar prosedürü (adım 4.2). </li><li> Bireysel zaman noktaları daha önce tarif edildiği nokta deneyi gibi benzer yöntemler kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Yen, J., Golan, R., Rubins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+infection+&amp;+temporal+analysis+of+virus+gene+expression:+part+1.">Vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 1.</a> J Vis Exp. 26 (26), (2009).</li><li>Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiZyme:+a+novel+fusion+protein-mediating+selection+of+vaccinia+virus+recombinants+by+fluorescence+and+antibiotic+resistance.">BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance.</a> BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).</li><li>Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+vaccinia+viruses+via+green+fluorescent+protein+selection.">Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection.</a> DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).</li><li>Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+addition+of+tumor+necrosis+factor+plus+beta+interferon+induces+a+novel+synergistic+antiviral+state+against+poxviruses+in+primary+human+fibroblasts.">The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts.</a> Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).</li><li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera.">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).</li><li>Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high-throughput+vaccinia+virus+neutralization+assay+for+testing+smallpox+vaccine+efficacy+based+on+detection+of+green+fluorescent+protein.">A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein.</a> Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).</li><li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid,+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression.">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).</li><li>Dower, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pyridopyrimidinone+inhibitor+of+orthopoxviruses+from+a+diversity-oriented+synthesis+library.">Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Potential+of+the+Acyclic+Nucleoside+Phosphonates+Cidofovir,+Adefovir,+and+Tenofovir+in+Treatment+of+DNA+Virus+and+Retrovirus+Infections.">Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).</li><li>Prichard, M. N., Kern, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthopoxvirus+Targets+for+the+Development+of+New+Antiviral+Agents.">Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents.</a> Antiviral Research. 10, (2012).</li><li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+successful+eradication+campaign.+Global+eradication+of+smallpox.">A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox.</a> Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).</li><li>Breman, J. G., Henderson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+dilemmas--monkeypox,+smallpox,+and+biologic+terrorism.+The+New+England.">Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England.</a> Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).</li><li>Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+antiviral+therapeutics+for+smallpox,+monkeypox+and+other+orthopoxvirus+infections.">Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections.</a> Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).</li><li>Rimoin, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+increase+in+human+monkeypox+incidence+30+years+after+smallpox+vaccination+campaigns+cease+in+the+Democratic+Republic+of+Congo.">Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).</li><li>Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+vaccinia+virus:+effects+of+rifampin+on+the+intracellular+distribution+of+viral+protein+p65.">Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65.</a> Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).</li><li>Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+small-molecule+antiviral+ST-246+as+a+smallpox+therapeutic.">Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic.</a> Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).</li><li>Broyles, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+transcription.">Vaccinia virus transcription.</a> Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).</li><li>Condit, R. C., Niles, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+viral+transcription+elongation+and+termination+during+vaccinia+virus+infection.">Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).</li><li>D&#237;az-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+the+2-5A+synthetase/RNase+L+system+results+in+inhibition+of+vaccinia+virus+replication.">Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication.</a> Virology. 227 (1), 220-228 (1997).</li><li>Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ppp(A2&#8217;p)nA-dependent+RNase+by+a+temperature-sensitive+mutant+of+vaccinia+virus.">Modulation of ppp(A2&#8217;p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus.</a> Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).</li><li>S&#225;nchez-Puig, J. M., S&#225;nchez, L., Roy, G., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+different+leukocyte+cell+types+to+Vaccinia+virus+infection.">Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection.</a> Virology Journal. 1 (1), (2004).</li><li>Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+S2+cells+are+non-permissive+for+vaccinia+virus+DNA+replication+following+entry+via+low+pH-dependent+endocytosis+and+early+transcription.">Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription.</a> PLoS One. 6 (2), (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok ve hiçbir patent virüs veya tarama yöntemleri için bekleyen.

Burada, virüs replikasyonu, tekrar üretilebilir, gerçek zamanlı geri besleme ölçütleri temin eden bir çok-aşamalı vaccinia raportör virüsü (TRPV), pratik kullanımını tarif etmişlerdir. Iyi tanımlanmış bir çiçek virüsü inhibitörleri kullanarak, TRPV her bir inhibitör için eylem mekanizması ile anlaşılır uygun bir şekilde tepki olduğunu gösterebilmişlerdir. TRPV virüs virüs evre ilerleme hakkında en kapsamlı bilgi sunarken, iki aşamalı (IREV, LREV) ve tek kademeli (EV, IV, LV) vir?...

Geleneksel olarak, virüs ifade moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, Kuzey leke, western blot, mikrodizi hibridizasyon, vb) 1 kullanılarak incelenmiştir. Bu yöntemler bireysel mRNA veya protein ifadesini değiştirir kategorize ile ilgili detaylı bilgi sağlama yeteneğine sahip olsa da, bunlar genellikle gerçek zamanlı ve yüksek verimli işlemlere uygun değildir. Poksvirüslerden çalışırken floresan tabanlı gazetecilere kullanarak alternatif yaklaşımlar önceden uygulanmış; Ancak, onların gelişimi ve kullanımı çeşitli amaçlarla tarafından motive edilmiştir. Bu gibi birkaç yöntem rekombinant virüslerin 2,3 seçimi için tasarlanmıştır. Bu teknikler dahil edilmesi ve uygun rekombinant vaccinia klonlardan eksojen DNA&#39;nın sentezlenmesi üzerine EGFP ifade eder. Benzer şekilde, birçok aşı suşları stabil bir şekilde çözünür EGFP ifade eden ya da yerel bir ineklerdeki çiçek hastalığı promotörün kontrolü altında eksprese GFP-etiketli proteinler, yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tip vardırically virüs giriş ve replikasyon antikor bazlı nötralizasyon deneyleri sırasında, kimyasal önleme veya antiviral etkinliği 4-6 karşılaştırma ölçmek için kullanılır. Bu virüsler yararlı olduğu kanıtlanmış olsa da, onlar yüzünden bir tek muğlak erken / geç viral desteğin onların kullanımına engellenmesi noktası hakkında detaylı bilgi vermek için kendi yeteneği sınırlıdır. Önceki yöntemler de optimal sinyal-gürültü özellikleri ile EGFP protein kullanımı yaptık. Nedeniyle poksvirüs çoğaltma ve viral gen ifadesinde gerçek zamanlı değişiklikleri tahlil için kullanılabilir mevcut araçların eksikliği karmaşıklığı, biz tek ve çok kademeli muhabiri virüsler 7,8 paketi geliştirdik. Daha önceki yayınlarda tarif edildiği gibi, bu virüsler, erken enfeksiyon içinde bir ara madde ya da geç aşamaları sırasında bir, iki, veya yerel vaccinia promoterler üç ayrı spektral floresan proteinleri ifade eder. Bu virüsler bizi olabilirflöresanlı bir mikroskop kullanılarak virüs replikasyonu ilerleme göstergesi olarak ed ve yüksek verimli ve plaka-okuyucu bazlı tahliller için de aynı derecede uygundur. Bu virüsler eşdeğer titreleri 7 ulaşmak için benzer kinetik ile büyüyen, yabani tip virüs yerine kullanmak kolaydır. Planlama ve bu virüslerin yaratılması sırasında, çok bakım ifadesi (Venüs, mCherry ve TagBFP) değişikliklere hızlı bir geri besleme ile güvenilir ölçümü kolaylaştırmak için üstün katlama verimlilik ile yüksek sinyal-zemin özelliklerine sahip florosforlar seçiminde alındı. Ek olarak, viral promoterlerin kombinasyonları belirsiz aksine, yüksek bağlılık, açık safha spesifik ifadesi, (C11R promoter) erken dizi hakkında bilgi veren, ara madde (G8R promotör) ve geç (F17R promoter) gen ekspresyonunu üreten seçilmiştir erken / geç promoterleri. Bu virüsler inve için bir araç olarak da kullanılabilirPrototipik çiçek virüsü, vaccinia virüs yaşam döngüsünü stigating. Çok çalışmanın uzun tarihine rağmen hala konak-virüs etkileşimi hakkında bilinen değildir. Vaksiniya immunomodulator ve uzlaşmaz ev sahipliği birçoğu 200 üzerinde benzersiz proteinlerini üreten, karmaşık. Enfeksiyon üzerine, ineklerdeki çiçek hastalığı virüsü erken hemen mRNA transkripsiyonunu başlar. Bu virion paketleme sırasında viral genom üzerinde yüklenir ve daha sonraki enfeksiyonlar kadar durdurulmuş halde yapıldı bir RNA polimeraz ve transkripsiyon faktörleri tarafından kolaylaştırılır. Bu erken ifade esas konakçı bağışıklık sistemi (mRNA Dekapaj, dsRNA sekestrasyon ve yem reseptör proteinleri hem de apoptoz inhibitörleri, stres tepkisi ve Toll, IL, ve NF-KB sinyal) ve genom replikasyon bastırılması için gerekli proteinler üretir. Erken ifade aynı zamanda ara ekspresyon için gerekli transkripsiyon faktörlerini üretir. Ara madde ifade geç aşama transkripsiyon faktörlerinin ortaya çıkarılmasını içerir. Buifade kademeli olgun vaccinia virionun tam montaj için gerekli olan enfeksiyonun geç aşamalarında sırasında yapısal ve enzimatik virüs proteinlerinin üretimine yol açar. Floresan haberci virüslerinin Bizim grubu poksvirüs biyoloji anlaşılmasında yapılacak hızlı bir ilerleme sağlar. Viroloji alanında en yaygın ve zaman alıcı bir yöntemlerden biri büyüme deneyidir. Bu, tipik olarak, hücrelerin enfekte enfekte hücreleri lize ile tedaviler, hasat virüs bir dizi yürürlüğe koymak ve plak tahlili ile elde edilen viral titresi miktarının içerir. Burada açıklanan raportör virüs kullanılarak kolayca deneye tabi tutulur ve paralel olarak gerçekleştirilen işlemler arasında çok sayıda mukayese edilebilir virüs büyüme gerçek zaman ölçümünü sağlar. Bu reaktifler, bu dizi ilaç tedavisi, RNAi k tepki olarak viral gen ekspresyonunda değişiklikler belirlenmesi için çeşitli protokoller kullanılacak öngörmeknockdown, veya konak aralığı kısıtlama. Bu yöntem de ilginç spesifik olarak tanımlanmış hedef aşamaları için yüksek verimli bir anti-viral ilaç ekranlar için izin veren, önceden mevcut olandan daha büyük bir ölçekte, yüksek içerik analizini sağlar. Çiçek virüsü enfeksiyon ile mücadele etmek için çok sayıda olası tedaviler tespit edilmiş olsa da, sadece FDA çiçek virüsü enfeksiyonunun tedavi edilmesi için etkili tedaviler Asiklik nükleosit fosfonat, Cidofovir, ve vaccinia immün globulin 9,10 ile tedavi edilir onayladı. 1977 11 çiçek eradikasyonu rağmen, poxvirüsler insan sağlığı 12 için önemli bir tehdit olmaya devam etmektedir. Variola virüsüne karşı yaygın aşılama bırakma diğer çiçek virüsleri 13 için artmış duyarlılık yol açmıştır. Örneğin, daha önce aşılama tarafından korunan Orta Afrika bölgelerinde Monkeypox virüs enfeksiyonlarına 14 bir artış yaşanıyor. Önemli endişe de olmuşturVariola virüsün kasıtlı serbest bırakılması için gizli duyarlılık konusunda kaldırdı. Nedeniyle, şu anda mevcut olan sınırlı tedavilere, yeni tedavilerin geliştirilmesi yönünde acil bir ihtiyaç vardır. Bu raportör virüsler, viral replikasyonun spesifik bir aşamasının önlenmesi için hızlı ve yüksek verimli, küçük molekül inhibitörü, tarama izin verir. Inhibisyon anda değil hedef viral sentezleme evreleri hedefleyen önleyicilerinin tespiti yüksek etki ile kombinasyon tedavilerinin geliştirilmesini kolaylaştırır. Kadar her aşamanın gen ifadesi değişikliklerini gözlemleyerek aşı hücre biyolojisi hakkında toplanan olabilir. Kimyasal ya da enfekte olmuş konakçı hücrenin genetik manipülasyonu ile zayıflatılması tipik haliyle düşük viral titreleri cinsinden ifade edilir. Ancak, viral sentezleme kaskadının her safhasında değişiklik karşılaştırarak, bir virüs uygunluk etkisinin ne kadar daha kapsamlı bir anlayış elde edebilirsinizBelirli bir tedavi ile ed. Bu veriler geleneksel virüs titresi çıkışı ile iyi bir korelasyon, ancak daha detaylı bilgi mekanistik hem de yüksek miktarda 7 yetenekleri temin ettiği gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1249">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:747px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11995-065</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">200 mM L-Glutamine, (L-glut)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>TRLVMF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB03091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1-&#946;-D-Arabinofuranosylcytosine&#160; (AraC), MW= 280 g/mol</td>
			<td>SigmaAldrich Co</td>
			<td>C6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">isatin &#946; -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9075202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Rifampicin, MW= 823 g/mol</td>
			<td>SigmaAldrich Co</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">ST-246, MW= 376 g/mol</td>
			<td>SIGA Labs, Corvallis, OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TempPlate RT optically clear film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2978-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression

Poxvirüsler aktif insan gibi Monkeypox gibi patojenleri, molluscum contagiousum ve Contagalo virüsü, çift sarmallı DNA virüsleri bir aileyiz. Aile de çiçek virüsü, Variola içerir. Nedeniyle poksvirüs çoğaltma karmaşıklığı, pek çok soru hala gen ekspresyon stratejisine ilişkin kalır. Bu yazıda, bir yüksek verimli bir biçimde viral gen ekspresyonu, tek ve çok sayıda etap gerçek zaman ölçümünü sağlayacak rekombinant vaccinia virüsleri kavramsallaştırılmasını ve kullanımını tarif eder. Bu, viral replikasyon üç aşamada her biri için ayrı bir muhabir olarak, spektral floresan proteinlerinin kullanımı ile etkinleştirilir. Aşama özel ekspresyonu, etkinleştirme plaka bazlı tahliller ve virüs yayılması ve replikasyon mikroskobik gözlemler korurken Bu virüsler yüksek sinyal-gürültü oranını sağlar. Bu araçlar antiviral keşif, virüs-konak etkileşim çalışmaları, ve evrimsel biyo için kullanan varlogy.

Bu virüslerin tipik bir kullanım örneği olarak, üç floresan haberci virüs çok iyi tanımlanmış bir çiçek virüsü inhibitörlerinin inhibisyon noktasını karşılaştırmak için kullanıldı. HeLa hücreleri, siyah duvarlı açık, düz tabanlı 96 oyuklu plakalar işlemden geçirildi ve gece boyunca inkübe doku kültürü içinde plakalanmıştır. (TRPV Tablo 1) karışmış mono tabakalar üç raportör virüsü kullanarak 10 lik çoklu enfeksiyon (MOI) enf...

Watch this Scientific Journal Video about Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression at JoVE.com

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

vaccinia-reporter-viruses-for-quantifying-viral-function-at-all

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K Görüntüleme.  Boston University School of Medicine.  Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem. 

Video: Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony forming units (CFU-Es). After CFU-Es, cells are morphologically recognizable and generally termed terminal erythroblasts. One of the challenges for the study of terminal erythropoiesis is the lack of experimental approaches to dissect gene functions in a chronological manner. In this protocol, we describe a unique strategy to determine gene functions in the early and late stages of terminal erythropoiesis. In this system, mouse fetal liver TER119 (mature erythroid cell marker) negative erythroblasts were purified and transduced with exogenous expression of cDNAs or small hairpin RNAs (shRNAs) for the genes of interest. The cells were subsequently cultured in medium containing growth factors other than erythropoietin (Epo) to maintain their progenitor stage for 12 hr while allowing the exogenous cDNAs or shRNAs to express. The cells were changed to Epo medium after 12 hr to induce cell differentiation and proliferation while the exogenous genetic materials were already expressed. This protocol facilitates analysis of gene functions in the early stage of terminal erythropoiesis. To study late stage terminal erythropoiesis, cells were immediately cultured in Epo medium after transduction. In this way, the cells were already differentiated to the late stage of terminal erythropoiesis when the transduced genetic materials were expressed. We recommend a general application of this strategy that would help understand detailed gene functions in different stages of terminal erythropoiesis.

We present an in vitro mouse fetal liver erythroblast culture system that dissects the early and late stages of terminal erythropoiesis. This system facilitates functional analysis of specific genes in different developmental stages.

Fare Fetal Karaciğer Kültür Sistemi Terminali Eritropoiesis Erken ve Geç Dönemlerinde Hedef Gene İşlevleri teşrih etmek

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...