Bu protokol, nadir, antijene özgü B hücrelerini tanımlamak için insan donörlerin bağışıklık repertoirelerini sorgulamak için kullanılabildiği için önemlidir. Bu teknik bize hızla klonlanabilir yerli eşleştirilmiş ağır ve hafif zincirler elde etmek için izin verir, ve daha sonra doğrudan ilgi antijen veya antijenlere karşı test edilebilir. Prosedürü gösteren Mike Morton, laboratuarımızdan bir teknisyen.
Erime ve iyileşmeden en az bir saat sonra, donör PBMC'yi santrifüj ile toplayın. Ve 50 mililitre lik buz gibi mes tampondaki hücreleri tekrar askıya alın. Hücreleri başka bir santrifüj le peletleyin ve STANDART protokollere göre CD22 mikroboncukları ile pozitif seçilerek CD22-pozitif B hücrelerini izole edin.
Boncuk izole CD22-pozitif hücreleri santrifüj ile toplamak ve Vax tampon konsantrasyonu mililitre başına yedinci hücrelere dört kez 10 hücreleri resuspend. Nazik karıştırma ile üreticinin seyreltme önerilerine göre hücrelere bir IgG CD19 CD27 antikor kokteyl ilerve aliquot 10 negatif kontrol için 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine yedinci hücrelere. Bir PE ve APC ile her 36 nanomolar son konsantrasyonunda negatif kontrol tüpü ne çift etiketli biotin steptavidin tetramers ekleyin, sıralama tüp peptidlerin sayısı ile çarpılır.
Taze Vax tampon ile her tüp 2,5 mililitre son hacmi getirin ve 36 nanomolar her PE ve APC de tüp sıralama peptid tetramerleri ekleyin. Santrifüjden sonra hücreleri, 30 ila 60 dakikalık bir kuluçka için 100 mikrolitre de 6'ya kadar, karanlıkta, dört santigrat derecede, rotasyonla iki katına getirin. Kuluçka sonunda, örnekleri tek tek beş mililitrelik filtre kapağı tüplere sokmadan önce hücreleri yıkama başına taze TBS tamponuyla iki kez yıkayın.
Hücre zarı bütünlüğünün bir belirteci olarak DAPI 0.3 mikromolar son konsantrasyonu ile leke örnekleri. Ve tek hücre sıralama için uygun hücre popülasyonları izole etmek için akış sitometri kapılarını ayarlamak için hücre ayırıcıüzerinde tüm negatif kontrol çalıştırın. Antijen PE karşı antijen APC arsa ve bir antijen PE-pozitif olarak R8 kapı ayarlamak, ve Çift pozitif kapı olayların düşük sayıda APC-pozitif çeyreği.
Sonra, tek CD19-pozitif CD27-pozitif antijen PE-pozitif sıralamak, bir Master Mix bireysel kuyular içine antijen APC-pozitif hücreleri 96 iyi plaka hazırladı. Sıralamanın sonunda, alüminyum bant pedleri ile plaka kapağı ve eksi 80 derece depolama önce 400 kez g bir dakika hücreleri santrifüj. Ters transkriptaz reaksiyonu gerçekleştirmek için, plakayı 3300 kez g'de iki dakika döndürmeden önce buz üzerinde sıralanmış B-hücrelerini iki dakika eritin ve kuyu içeriğini açmadan önce plakanın altına çekin.
Uygun bir enzim Master Mix ile hücreleri tedavi ettikten sonra, her PCR reaksiyonu için bir şablon olarak ücretsiz DNA 2,5 mikrolitre ekleyin ve her reaksiyon için 1 mikromolar son konsantrasyonuna astar ekleyin. Daha sonra, reaksiyon başına 25 mikrolitre son hacmi getirmek için her iyi 10X polimeraz tampon 2X konsantrasyonu ekleyin. Ve her biri 50 döngü boyunca ağır ve hafif zincirLI PCR reaksiyonlarını çalıştırın.
Reaksiyonların sonunda, pozitif amplifikasyon isabetleri görselleştirmek için% 1 agarose jel üzerinde örnekleri çalıştırın. Jel çıkarma yoluyla aynı hücreden eşleştirilmiş ağır ve hafif zincir reaksiyonlarını izole edin. Doğru ligasyon karışımı hesaplamaları için DNA parça konsantrasyonunu optik yoğunluk 60'a göre belirleyin.
Kurtarılan ağır ve hafif zincir parçalarını bir bağlayıcı parçası ve ifade vektör omurgası ile üreticinin talimatlarına göre dört parçalı ligasyon reaksiyonu kullanarak birleştirin. Ve üreticinin talimatlarına göre kimyasal olarak yetkin bakterilere ligasyon reaksiyonları dönüştürmek. Bir kez antibiyotik plakaları üzerine plakalı, dakikada 250 rotasyonlar 37 santigrat derece de kuluçka için kalan dönüşüm kültürüne antibiyotik ile büyüme orta dört mililitre ekleyin.
Ertesi sabah, üreticinin talimatlarına göre bir gecede ligasyon karışımı kültürlerden bir miniprep DNA hazırlamak ve ortaya çıkan plazmid DNA konsantrasyonunu belirlemek. İzole antikorların antijen özgüllüğünü doğrulamak için, 293 hücrenin 10 mililitrelik süspansiyonunda katyonik lipid baz reaktifi ile miniprep DNA'nın transfect 10 mikrogramı. Hücre kültürünü 3-4 gün 37 santigrat derece, %8 karbondioksit ve dakikada 125 dönüşle kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, 1000 kez g 10 dakika kültür santrifüj ve açıklık orta kurtarmak. Protein A'ya yakınlık yoluyla süpernatanttaki IgG konsantrasyonu ölçün ve her antikoru elisa tarafından mililitre konsantrasyonu başına 25 mikrogramda standart ELISA protokollerine göre sıralamaiçin kullanılan bireysel peptidlere karşı test edin. Daha sonra, mililitre başına 20 mikrolitreden başlayan ve ilk ekran ELISA'ya reaktivite gösteren her antijen için optik yoğunluğa karşı çizim yapmak için IgG supernatant seyreltmelerini kullanarak ekran pozitif vuruşlarını onaylayın.
Antijene özgü antikorları insan donörlerinden izole etmek için, hedef bellek B-hücrelerini izole etmek için bir dizi sitometri kapısı tasarlanabilir. Lenfositler ileri ve yan dağılım kullanılarak hücre büyüklüğüne ve granüleritliğine göre izole edilirler. Doublets ve ölü hücrelerin dışlanmasından sonra, henotibik belirteçler IgG-pozitif CD19-pozitif B-hücrelerinin ve CD27-pozitif bellek B-hücrelerinin ayrılmasına olanak sağlar.
Tek hücreli klonlamanın ilk okuması, ilgili ağır ve hafif değişken zincirlerin amplifikasyonunun bir teyididir. Burada, PCR gösterildikten sonra %42 eşleştirilmiş kurtarma ile 24 tek hücreden çok verimli bir amplifikasyon örneği. IgG klonlama sonrasında, IgG ekspresyonu vektörü insan embriyonik böbrek 293 hücrelerine geçirilir.
Kurtarılan antikorlar ELISA tarafından reaktivite için puan Tau peptidler orijinal paneli karşı taranır. Ek onay daha sonra ilk ekranda tanımlanan peptidler karşı aynı rekombinant antikor örneklerinin bir konsantrasyon eğrisi kullanılarak tamamlanır. Her pozitif vuruş için, tek bir plazmid klon dönüştürülmüş havuzdan izole edilebilir ve aynı ELISA yöntemi ile yeniden teyit edilebilir.
Amaç tek hücrelerden gelen dizileri yükseltmektir, bu nedenle hatırlanması gereken en önemli şey, bu işlemin PCR kısmı sırasında herhangi bir kontaminasyonun arttırılmasıdır. Bu prosedür, üretmek istediğiniz kadar antikor saflaştırma ve fonksiyonel karakterizasyonu sağlar bozulmamış insan rekombinant antikorlar, verir.
