Bu çalışma KT Ulusal Sağlık Enstitüleri (NCI R00 CA132784) tarafından desteklenmiştir

1. Kordon Kanı gelen Mononükleer Hücreleri İzolasyon <ol><li> EDTA-PBS 95 ml durulama tamponu (1:20 seyreltme) 5 ml sığır serum albumini (BSA) stok solüsyonu tampon ekleyin hazırlayın. Degas tampon ve buz üzerinde arabellek tutmak ÖNEMLİ:. Degas uyulmaması CD19 izole ederken tampon optimum sonuçlar daha az neden olabilir + kabarcıklar yalıtım sütun engelleyebilir B-hücreleri çünkü. </li><li> Yoğunluk gradiyenti santrifüj için 50 ml konik tüpler hazırlayın. Kordon kanı işleme için gerekli tüp sayısı (1 tüp 8 ml kan işleyebilir) belirleyin ve her tüpe Ficoll-Paque PLUS 15 ml ekleyin. </li><li> 24 ml DPBS (1X) ve dikkatli bir tabaka 50 ml konik tüpler her Ficoll-Paque PLUS üstüne seyreltilmiş kordon kanı karışımı ile kordon kanı 8 ml seyreltin. Kan ve Ficoll-Paque PLUS karıştırmayınız ÖNEMLİ:. Kordon kanı ve Ficoll-Paque PLUS karışmalarını önlemek için, 45 derecelik bir açıyla tüp tutun vetabaka kan karışım yavaşça. </li><li> 20 ° C&#39;de 40 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin Mononükleer hücreler (MNC) kalacaktır plazma Ficoll-Paque PLUS arayüzü Ficoll-Paque PLUS ozmotik basınç daha yüksek yoğunluğu nedeniyle sediman granülosit ve eritrosit oysa. Örnek kimliği, tarihi ve aşağıdaki ile Bölüm 3 kullanılmak üzere Etiket yedi 5 ml yuvarlak tabanlı tüpler: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tüp </td><td> Etiket </td><td> Amaç </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Renksiz </td><td> Akım sitometri sırasında normalleşmesi için boyanmamış hücreler </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> Flow sitometri esnasında canlılığını belirlemek için </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> Sıralanır hücreleri içerir </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> CD34 + / CD19 toplamak için +(Geç pro-B - erken pre-BI) hücreler </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Düşük 45 </td><td> / CD19 düşük + / CD45 (pre-BI) hücreleri - CD34 toplamak için </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 med </td><td> / CD19 + / CD45 med (pre-BII) hücreleri - CD34 toplamak için </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Yüksek 45 </td><td> / CD19 + / CD45 yüksek (immatür B) hücreleri - CD34 toplamak için </td></tr></tbody></table> Coat boruları 4, 5, 6, 7 ve% 2 FBS ile ve buz üzerinde her tüpleri. <ol start="5"><li> Dikkatle üst plazma tabakası aspire ve mononükleer hücre tabakası ile temasından kaçının. 10 ml&#39;lik cam pipet kullanarak dikkatlice yeni bir 50 ml konik tüp mononükleer hücre tabakası aktarın. Tek bir 50 ml tüp içine birlikte üç tüpler mononükleer hücreleri birleştirin. </li><li> PBS ile tüp doldurun, 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de hafifçe karıştırın ve santrifüj20 ° C. Hücre pelletini bozmadan süpernatant dikkatlice aspire. 1x tekrarlayın. İlk yıkama sonra, pelet tekrar süspansiyon haline getirin ve tek bir 50 ml&#39;lik konik tüpe aktarılır. </li><li> Yavaşça PBS içinde 200 ul hücre pelet tekrar süspansiyon. , Hücre süspansiyonu 1 ul çıkarın 1,5 ml mikrosantrifüj tüp PBS 1 ml ekleyin ve (santrifüj 50 ml hücre süspansiyonu yerleştirdikten sonra hücreleri saymak) sayım için kenara koyun. PBS ile tüp doldurun ve trombositleri uzaklaştırmak için 15 dakika için 200 x g&#39;da santrifüjlenir. Hücre pelletini bozmadan tamamen Süpernatantı. </li></ol> 2. MACS Ayrılması Mononükleer Hücreler Modifiye B hücre izolasyonu <ol><li> 160 ul soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon ile adım 1.7 &#39;den pelet yeniden süspanse edin. </li><li> 40 ul B KLL biotin antikor kokteyli ekleyin. 4 ° C&#39;de karıştırın ve 10 dakika için inkübe pipet </li><li> Yıkayın hücrelerini - 1 ml soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon milyon başına 10 hücreleri (hücre nu eklemekmber adım 1.7) belirlenen ve 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj. Tamamen süpernatan aspire ve daha sonra 320 ul soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon içinde tekrar süspansiyon hücre peleti. </li><li> 80 ul anti-biotin mikro-küreler ekleme, 4 ° C&#39;de karıştırın ve 15 dakika için inkübe </li><li> Yıkayın hücrelerini - 1 ml soğuk 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de (4 ° C) EDTA-PBS tampon milyon hücre başına 10 ve santrifüj ekleyin. Soğuk 500 ul (4 ° C) EDTA-PBS tamponu içinde 100 milyon hücre kadar tekrar. Hücre sayısına göre Ölçeği tampon hacmi. </li><li> Santrifüj (Adım 2.5) sırasında MACS Sütunlar ve MACS Ayırıcılar hazırlayın. MACS ayırıcı bir manyetik alan içinde bir LS sütun yerleştirin, 3 ml soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon sütun üzerine eklemek ve tampon sütunu boyunca damla izin verir. Aracılığıyla akış yakalamak için bir kap kullanın. Aracılığıyla akış atın. </li><li> Sütununun altındaki bir 50 ml konik boru yerleştirin ve sütun üzerine hücre süspansiyonu pipetle. Etiketsiz hücreleri Throug damla izin verh kolon ve 50 ml konik bir tüp içine. Önemli: Bu antikor etiketleme ve hücre sıralama için kullanılacak olan hücrelerdir. Aracılığıyla akış atmayın. Adım 2,5 hücrelerin tümü kurtarmak için, konik boru duvarları ile soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon ilave bir 1 ml ekleyin. İyice karıştırın ve sütun üzerine, geri kalan hücre süspansiyonu pipetle. 1x tekrarlayın. Sütun geçtikten sonra konik tüp toplanan etiketsiz hücreleri kullanılarak 2.8 adıma geçin. </li><li> 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de PBS ve santrifüj ile etiketsiz hücreleri içeren konik tüp doldurun. Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. EDTA-PBS 200 ul ekleyin ve hafifçe hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 3. Hücre Ayırma için antikor Etiketleme ve Hazırlık <ol><li> (Adım 1.4) &quot;lekesiz&quot; etiketli tüpe hücre süspansiyonu ve yerin 1 ul aspire. 500 ul EDTA-PBS tamponu ekleyin ve buz üzerinde tüp saklayın. </li><li> 20 EkleKalan hücre süspansiyonu içine milyon hücre başına her bir antikorun ul (CD19, CD34 ve CD45). İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika süreyle karanlıkta tüpü yerleştirin. Işıklar kapalı CD antikorlar 2-4 ışığa duyarlı, tam adımlardır. </li><li> Antikor ile inkübasyon 30 dakika sonra, hücre süspansiyonu, 40 ul aspire ve &quot;7AAD&quot; etiketli tüp içine yerleştirin. 2 dakika süreyle 500 xg&#39;de boru ve santrifüj içine 1 ml PBS ekleyin. Süpernatantı ve bağlayıcı tampon içinde 100 ul hücre tekrar süspansiyon. 7AAD 7 ul (7-Aminoactinomycin D) eklenir ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilir. 10 dakika inkübasyon tam adım 3.4 sırasında. </li><li> CD antikorlar ile etiketlenmiş kalan hücreler içeren tüpün üst PBS ekleyin. 3 dakika boyunca 500 xg&#39;de tüp santrifüjleyin. Süpernatantı, 500 ul EDTA-PBS tamponu ekleyin ve hücre pelet tekrar süspansiyon haline getirin. &quot;+ + +&quot; Etiketli tüpe hücre süspansiyonu tüm hacmi aktarın. Hücre süspansiyonu bir bütün kurtarmak için&quot;+ + +&quot; etiketli tüpe 50 ml konik tüp ve transfer için dd ek 1 ml EDTA-PBS tamponu. </li><li> Inkübasyondan sonra (Adım 3.3), 7AAD tüpüne 300 ul bağlayıcı tampon eklemek. &quot;Lekesiz&quot;, &quot;7AAD&quot; ve &quot;+ + +&quot; örnekleri ve &quot;34 +&quot;, &quot;45 düşük&quot; &quot;45 med&quot; ve &quot;45 yüksek&quot; tüpleri Akım sitometri için hazırız. </li></ol> 4. MoFlo XDP Akış Sitometresi kullanma Hücre Ayırma <ol><li> Sıralama için Set-up MoFlo: lazerler hizalayın; damlacık akışı stabilize; damla gecikme belirler. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre Invitrogen ABC Fare boncuk seti (veya benzeri) kullanarak tek renk telafisi denetimleri hazırlayın. Pozitif ve negatif popülasyonları optimum ayrılması için floresans kanallarının voltaj ayarlayarak, tek renk kontrolleri çalıştırın. Kompanzasyon katsayılarını ayarlayın ve telafi parametre koleksiyonu protokolü uygulanır. Kompanzasyon katsayılarını antikor yeni bir sürü elde edilir her seferinde yeniden kurmak. </li><li> Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi çizer dahil protokol oluşturur. </li><li> , Boyanmamış örnek Çalıştır gerilim ve ileri ve yan dağılım için kazancı ayarlayın ve negatif floresan popülasyonları tanımlamak. DNA kurtarma tür hedefi olduğundan, eşik DNA içeren enkaz kurtarıldı örnekleri kontamine etmez (≤ ​​1%) düşük şekilde ayarlanmış olmalıdır. * Aerosol Tahliye Sistemi insan hücrelerinde MoFlo üzerinde yürütülüyor yaşamak her zaman çalıştığından emin olun. </li><li> Yolluk stratejisi (Şekil 2) ayarlamak için + + + örnek (~ 50.000 olay) küçük bir kısım çalıştırın. B-hücre progenitörlerinin B-hücrelerinin olgunlaşması için aynı dağılım yok Çünkü, lenfosit kapısı potansiyeli Pro-B hücreleri içeren sağlamak için SSC vs FSC arsa üzerine + / CD34 + nüfus ungated CD19 backgate. Bu örnekten de 7AAD için negatif floresans nüfus ayarlayın. </li><li> Örnek canlılığı belirlemek için 7AAD örnek çalıştırın. Yüksek canlılığı ile örnek sadece tür hücrelerölü hücreler olarak başından (≥% 95) gelişigüzel leke olacaktır ve sıralama nüfus kirletebilir. </li><li> Dört nüfus toplamak tür kararlar ayarlayın: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 düşük; CD19 + / CD34 - / CD45 med ve CD19 + / CD34 - yüksek / CD45. Tüm nüfus tür kararlarında lenfosit ve çiftleri ayrımcılık kapıları ekleyin. </li><li> Sıralama ucu takunya önlemek için, filtre + + hemen sıralama ve herhangi bir kümeleme sıralama sırasında örnek oluşursa yeniden filtresi önce 40 mikron hücre süzgecinden + örnek. </li><li> Bir soğutmalı veya buz dolu bir tüp tutucu PBS içinde% 2 FBS ile kaplı toplama tüpleri (Adım 1.4) içine hücreleri sıralayın. </li><li> Sıralama tamamlandıktan hemen sonra, DNA ayıklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+(TDMs)+with+differential+gene+expression.">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li><li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells.">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis.">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li><li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow.">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li><li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development.">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li><li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow.">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li><li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature?.">Are cord blood B cells functionally mature?.</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li><li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci.">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li><li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children.">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li><li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression.">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li><li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis.">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li><li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , 7.1.1-7.1.7 (1996).</li><li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+human+B-cell+precursors.">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li><li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells.">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li><li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+immature/transitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease:+correlation+with+increased+IL-7.">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Protokolün başarısı üzerinde en büyük etkiye sahip faktör enkaz kirletici varlığıdır. Bir kordon kanı bankası kanı isteyen varsa bu kanın en kısa sürede toplama sonra mümkün sevk olması önemlidir. Buna ek olarak, lenfositoz olarak sınıflandırılan örnekleri lenfositlerin yüksek sayılar içeren, ancak bu örnekler prekürsör B-hücrelerinin yeterli sayıda yoktur ve kullanılmamalıdır. Biz kordon kanı en az 85 ml ile başlayan tavsiye habercisi altkümelerini her hücrelerin yeterli sayıda elde etme olasılığını artırmak için. Bu yetişkin periferik kan ayrımları aksine, göbek kordonu kanı fractionating zaman mononükleer katmanı çoğunlukla kırmızı kan hücreleri 12 ile kontamine olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu protokol, kontamine trombositleri uzaklaştırmak için ilave bir yıkama aşamasını içerir. Kordon kanı mononükleer ayrımları anlatan Protokoller lizis adım t dahil öneririzİstenmeyen kırmızı hücreleri çıkarmak o. Kontaminasyonu enkaz üretir ve hücrenin tür başarısı üzerinde olumsuz bir etkisi vardır, çünkü biz bu adımı önermiyoruz. Akış sitometrisi ile ayırt edilmesi gereken hücrelerin sayısını azaltmak için, bu önceki hücre sıralama için, bir B-hücresi zenginleştirme gerçekleştirmek için gereklidir. B-Hücre İzolasyon Kiti (B KLL) eşlik Miltenyi Biotec, tarafından sağlanan protokolü periferik kan için optimize edilmiş ve 10 milyon hücre başına 10 ul B KLL biotin antikor kokteyli kullanılmasını önerir edilmiştir. , CD4 (T hücreleri), CD11b (granülositler, monositler, makrofajlar), CD16 (NK hücreleri, makrofajlar, mast hücreleri), CD36 (trombosit), CD235a (eritroid hücreler); Bu adım, CD2 (NK hücreleri, T hücreleri) karşı antikorlar kullanan göbek kordon kanı olmayan B hücreleri tüketmek. Bu, eski kit pro-B hücreleri üzerinde mevcut olan CD43 karşı bir antikor içerir, çünkü tarif edilen kit olup, B-hücre izolasyon kiti II kullanımı için çok önemlidir. Bizim op sırasındaBu protokolün timization, biz B KLL biotin antikor kokteyli 40 ul toplam bir pozitif hücre sıralama sonucu üretmek için yeterli olduğunu buldular. Ayrıca biz B KLL biotin antikor kokteyli az 5 olarak ul fazla kullanarak hücre sıralama üzerinde olumsuz etkileri olduğunu bulmuşlardır. Bu nedenle, biz çok 175-250000000 arasındaki toplam mononükleer hücre numaraları için B KLL biotin antikor kokteyli 40 ul kullanmanızı öneririz. Hücrelerin daha düşük ya da daha yüksek sayılar ile başlangıç ​​durumunda buna uygun reaktifler büyütmek için gerekli olabilir. B-hücre alt-popülasyonları ayırmak için kullanılabilecek belirteçler anlatan sayısız çelişkili yayınlar vardır. Tutarsızlık çoğu farklılaşma devam eden bir işlem olup hücre yüzey işaretleyicileri arasında varlığında veya yokluğunda tedrici bir şekilde yerine bir bütün ya da hiç bir şekilde meydana geldiği gerçeği ile açıklanabilir. / CD19 + ve CD45 + (yoğunluk düzeyini - Bu protokol CD34düşük), yüksek, orta ifade farklılaşma 6 ilerlemesini tekabül eden CD45 ekspresyonunun seviyesinde bir artış ile ön-BI, önceden II ve olgunlaşmamış B hücreleri ayırmak için kullanılmıştır. Pro-B hücreleri CD19 Bazılarına göre tarif edilmiştir + / CD34 + 13 diğerleri pro-B hücreleri CD19 olduğunu göstermiştir iken - / CD34 + ve pre-BI hücreler CD19 + / CD34 + 9,10 vardır. Bu farklar dayanarak biz geç pro-B hücreleri / erken pre-BI hücreleri CD19 + / CD34 + hücrelerin tayin etmişler. Bu stratejinin öncüsü hastalık akut lenfoblastik lösemi etkilenen hücrelere karşılık B hücrelerinin alt yalıtmak için geliştirilen dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, ilgi hücre alt tipi bağlı olarak kullanılabilecektir birden fazla ayırma stratejiler vardır. Antikor-florokrom kombinasyonları kullanılabilir hücre sıralayıcı yeteneklerine göre seçilmelidir. Bir cins olarakl kural, sizin panelinde parlak florokrom en kalabalık antijen ve tersi etiketlemek için kullanılmalıdır. Özellikle çift-lekeli nüfus, bu gibi nadir olaylar belirlenmesinde, çifti ayrımcılık (Şekil 2B) yolluk stratejisinin hayati önem taşımaktadır. Bu, çift pozitif olayların antikorlar ve birbirlerine yapışık değil, sadece iki tek-boyanan hücreleri hem lekeli gerçekten tek hücre olmasını sağlar. Yüksek hız, 4-yönlü hücre sıralama mutlaka kontrollü bir aerosol ortam oluşturur. Bu nedenle, canlı insan hücre sıralama büyük bir dikkatle yapılmalıdır. Yayınlandı emniyet ve dekontaminasyon kuralları mevcuttur ve sıralama 14 önce incelenir ve uygulamaya konulmalıdır. Kurumsal Biyogüvenlik Komiteleri veya eşdeğerleri gelen Onay sıralama öncesinde gerekli olabilir. Sıralama sonra uygun arındırma için, çamaşır suyu% 10 oranında bir nihai konsantrasyon için çöp bidonu ilave edilmelidir. Similarly, tüm örnekler boru şeklinde, hem de hemen alan bütün yüzeyleri tamamen yeni hazırlanmış bir% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile arındırılır olmalıdır. Özetle, bu protokol prekürsör B-hücrelerinin nadir nüfus elde etmek için bir strateji sağlar ve hematopoetik kök hücreleri ve T hücreleri immatür dahil kordon kanında bulunan herhangi nadir nüfusa yalıtmak için modifiye edilebilir. Son zamanlarda, immatür B hücreleri ilerlemiş HIV 15 bireylerin periferik kan tespit edilmiştir. Bu nedenle, bu yöntemin yarar kan kanseri çalışma ötesine uzanır. Son olarak, henüz akış sıralanmış hücreleri üzerinde gerçekleştirilen RNA izolasyon değil, ancak, bu yöntem, hücre sırasında hücreler RNeasy kiti trizol ya da bu gibi RLT eşdeğer bir RNA uyumlu bir çözelti içine doğrudan sıralanması sıralamak uyarı ile uyumlu olmalıdır Qiagen aracılığıyla kullanılabilir.

Hastalık mevcut olan sapmaları tespit etmek amacıyla, sağlıklı dokuların ya da hastalıktan etkilenen doku ya da hücre tipine karşılık gelen hücreleri kullanılan son derece önemlidir. Bunun bir nedeni, doku tipleri arasındaki epigenetik varyasyon gen ekspresyonu düzenleyen sorumludur ve normal insan gelişiminin 1,2 sırasında hücresel farklılaşma için kritik olmasıdır. İkinci nedeni aberran doku spesifik gen regülasyonu normal gelişim korkunç sonuçlara neden olabilir ve kanser gibi hastalık durumları çok sayıda katkıda bilinir. Bu nedenle, hematopoietik hücreler içeren bir hastalık daha iyi anlaşılması sağlıklı hematopoietik hücrelerin bilinmesini gerektirir. Hücre yüzeyi ekspresyonu değişiklikleri ile karakterize edilen olayların sistematik bir düzen vasıtasıyla kemik iliği hematopoetik gelir hücrelerin gelişimi 3 markers. Yetişkin katılımcılar ile ilgili çalışmalar varPediatrik katılımcılar içeren çalışmalar prekürsör B-hücrelerinin yüzdesinin az 5 yaş 6 bireyler nispeten yüksek olduğunu göstermiştir iken; kemik iliği genellikle B-hücrelerinin 4,5 habercisi olarak düşük sayıda içerdiğini göstermiştir. Umbilikal kordon kanı, kan ile ilgili bozukluklar ve maligniteler tedavisinde hematopoietik kök hücre kaynağı olarak kullanılan kordon kanı bankalarının aracılığı ile kolay ulaşılabilir ve hedef lösemi olmak üzere birçok hastalıkların hücre ve olan immatür B ve T hücreleri 7 zenginleştirilmiştir edilir lenfomalar. Kemik iliği içinde Prekürsör B-hücrelerinin yaygın olarak 8,9 phenotyped edilmiştir ve ayrı alt bu hücrelerin sıralamak için kullanılan spesifik hücre yüzey işaretleyicileri arasında bulunması ile tanımlanır. Normal B-hücre farklılaşması erken pro-B hücreleri ile başlayan ve olgunlaşmamış ya da naif B hücrelerinin sonuçlanan kemik iliğinde aşamalarında bir dizi ilerler. Görevan Zelm ve meslektaşları 10, pro-B hücreleri CD34 varlığı ve evre 2 geçiş (Pre-BI) olarak CD19 kazanılır karakterizedir. 3. Aşama (Ön BII) hücreler artık CD34 ekspres ve sitoplazmik IgM ifade etmeye başlayacak. Nihayet, evre 4 bir belirleyici özelliği (B hücreleri immatür) yüzey IgM ifadesidir. Bu protokolü açıklanan sıralama stratejisi ilk Caldwell ve arkadaşlarının 6 tarafından tanımlanan ve büyük ölçüde karmaşıklığı ve hücre sıralama deneyler gerçekleştirme maliyetini düşürür sadece 3 hücre yüzey belirteçlerinin kullanımını içerir edildi. Onların çalışmasında, CD45 arasında bir ilişki ve B-hücre farklılaşması aşamaları kurulmuştur. Bunlar kemik iliği, B-hücreleri CD45 ekspresyonu değişken düzeyleri görüntülemek görülmektedir. Özel olarak, yüksek düzeyde CD45 hücrelerinin yüzeyinde ifade edilen IgM ifade hücreleri (B-hücreleri olgunlaşmamış) karşılık olarak, CD45, orta derecede ifade edilen, bu cytopl ifade hücreler denkasmic IgM (pre-BII hücreleri), ve CD45 düşük seviyelerde ifade olanların (pre-BI hücreleri) sitoplazmik IgM ifade vermedi hücreleri karşılık geldi. Bu protokol, örneğin metil-, CpG adası iyileşme testi gibi, yüksek kaliteli nükleik asit gerektiren alt-metodlarda kullanılan göbek bağı kanı (Şekil 1), B-hücrelerinin (MIRA haberci alt kümeleri izole etmek için Caldwell ve arkadaşları tarafından geliştirilen 6 strateji kullanır ) 11 ve kantitatif gerçek zamanlı PCR. Yöntemi göbek kordon kanı dışındaki tüm B hücreleri tüketmek için manyetik boncuklar kullanarak ilk ayrılık istihdam ediyor ve sadece 3 antikorlar (CD34, CD19 ve CD45) ile boyanarak gerektirir. Kurtarıldı hücreleri B-hücre farklılaşması 4 aşamaları temsil: 1) CD34 +, CD19 + (geç pro-B ve pre-BI erken); 2) CD34 -; CD19 +, CD45 düşük (geç ön-BI); 3) CD34 -; CD19 +, CD45 med (pre-BII) ve 4) CD34 -; CD19 +; CD45 yüksek (immatür B hücreleri).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multi Stand</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-660</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATLANTA Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>SS1500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560941</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347463</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CY30230</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck Alignment beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Rainbow Alignment beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URFP-30-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML01330</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Mouse bead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10344</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &mu;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Evacuation Unit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood

Göbek kordon kanı çok farklı soy bağlılığı aşamalarında hematopoetik progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir. Biz B-hücrelerinin farklılaşma dört farklı aşamalarında öncüsü izole etmek için bir protokol geliştirmiştir. Genlerin ifade ve epigenetik değişiklikler bir doku belirli bir şekilde meydana Çünkü, bu genomu ve hastalığın gelişmesine yol açabilir epigenom değişiklikler tespit edebilmek amacıyla doku ve hücre tipleri arasında ayrım önemlidir. Bu yöntem, ayırt herhangi bir aşamasında, göbek kordonu kanı hücre içinde mevcut herhangi bir tür için adapte edilebilir. Bu yöntem, 4 temel aşamalarını kapsamaktadır. İlk olarak, mononükleer hücreler yoğunluk santrifüj ile ayrılır. İkinci olarak, B-hücreleri mononükleer hücrelerden non-B-hücreleri tanımak ve çıkarmak biyotin konjuge antikor kullanılarak zenginleştirilmiştir. Üçüncü olarak, B-hücrelerinin fluoresan ayrı aşamalara spesifik hücre yüzeyi proteini antikorları ile etiketlenmiştirB hücre gelişimi. Son olarak, floresan işaretli hücrelerin sıralanır ve bireysel nüfus geri kazanılır. Geri kazanılan hücreler aşağı nükleik asit tahlillerde kullanılmak için yeterli miktar ve kalitede.

Örnek arası varyasyon hücre tür (Tablo 1) başarısında bir rol oynar. Iyi başarı oranları ile örnekleri kontamine enkaz düşük seviyelerde (Şekil 3A) sahip ve düşük başarı oranları ile örneklerin kontamine enkaz yüksek düzeyde (Şekil 3B) var. Kordon kanı örneği gönderi 24 saat (O / N öncelikli) bünyesinde toplandı eğer numune arasındaki varyasyon biraz kontrol edilebilir. Her prekürsör B-hücre alt gelen akış sıralanmış hücreleri yeterli miktar ve nükleik asit izolasyonu gerçekleştirmek kalitede. Izole edilen DNA, yüksek kaliteli ve aşağı analizlerinde kullanılabilir. Biz rutin denatüre DNA (Şekil 4) için zenginleştirmek MIRA 11 bu DNA kullanır. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Kordon Kanı Tesis Veri </td><td> Kötü sırala </td><td><strong&gt; İyi sırala </td></tr><tr><td> Antikoagülan Çalışma Kan Hacmi (ml) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> Beyaz Kan Hücreleri [10 3 / ul] </td><td> 8.68 </td><td> 11.19 </td></tr><tr><td> Lenfositler [10 3 / ul] </td><td> 3.88 </td><td> 3.76 </td></tr><tr><td> Lenfosit (%) </td><td> 44.70 </td><td> 33.6 </td></tr><tr><td> Kırmızı Kan Hücreleri [10 6 / ul] </td><td> 3.65 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td colspan="3"> In-house Veri </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque sonra Hücre Sayısı </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> MACS Ayrılık sonrası Hücre Sayısı </td><td> 22 M </td><td> 16,5 M </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik Sayısı (MoFlo XDP) </td><td> 30.57 M </td><td> 19,97 M </td></tr><tr><td> Canlılığı (%) </td><td> 98.00 </td><td> 98.00 </td></tr><tr><td> Lenfosit Gate Hücreleri (%) </td&gt; <td> 17.00 </td><td> 50.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> Toplam Hücre Sayısı </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik% </td><td> 0.04 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> Verim </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - düşük / CD45 </td></tr><tr><td> Toplam Hücre Sayısı </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik% </td><td> 0.05 </td><td> 0.13 </td></tr><tr><td> Verim </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 med </td></tr><tr><td> Toplam Hücre Sayısı </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik% </td><td> 1.54 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> Verim </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - yüksek / CD45 </td></tr><tr><td> Toplam Hücre Sayısı </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> Toplam Etkinlik% </td><td> 6.2 </td><td> 10.25 </td></tr><tr><td> Verim </td><td> 91% </td><td> % 90 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Örnek hücre sıralama istatistikleri. Satırlar 1-5 kordon kanı tesisi tarafından sağlanan sayıları vardır. Kalan satırların laboratuar toplanan veriler vardır. Yoksul çeşit enkaz yüksek düzeyleri ve lenfosit kapısı hücrelerin düşük bir oranda yer. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figu1 yeniden. Prosedürün Akış şeması. Göbek kordon kanı işlenir ve mononükleer hücreler Ficoll-Paque plus kullanılarak izole edilmiştir. Ek bir yıkama adımından kirletici trombositleri uzaklaştırmak için eklenmiştir. B-hücreleri MACS insan B-hücresi izolasyon kiti (B-CLL) kullanılarak mononükleer hücreler izole edilmiştir. Bu adım, tüm non-B hücreleri çıkarmak için (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE ve CD235a) biotin-konjuge monoklonal antikorlar kullanır. Kurtarılan B-hücreleri daha sonra prekürsör B-hücre alt kurtarmak için MoFlo XDP akış sitometresi kullanılarak sıralanır CD19-APC, CD34-PE ve CD45-FITC antikorlar ile etiketlenir: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 düşük ; CD19 + / CD34 - / CD45 med ve CD19 + / CD34 - yüksek / CD45. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> Şekil 2. Pop belirleme ve sıralama için gating stratejisiulations. Kırmızı oklar sonraki arsa uygulanır kapısı gösterir. R4, R5, R6 ve R7&#39;nin kapıları kriteri popülasyonları göstermektedir. A) ileri vs zenginleştirilmiş lenfosit popülasyonu yan dağılım gösteren bir arsa. R1, lenfosit kapısı. B) Yükseklik vs tek hücre karşısında çiftler belirlenmesi için forward scatter plot genişliği. R2, tek bir hücre kapısı. C) CD19-APC pozitif hücreler CD34-PE pozitif ve negatif popülasyonları içine düşmek. R3, CD19 + / CD34 - kapısı; R4, CD19 + / CD34 + kapı belirten istenen tür nüfus d) CD19 + / CD34 - hücreleri üç biraz farklı CD45-FITC nüfus girer.. R5 ve R6, CD19 + / CD34 + / - düşük CD45 ve CD19 + / CD34 + / - CD45 med popülasyonları, sırasıyla. R7, çünkü CD19 + / CD34 yüksek hücre sayıları arasında - yüksek nüfus / CD45, bu tür kapı sadece kapsarnüfusun bir bölümü. Bu nüfusun tüm hücreler aşağı analizler için toplanan gerekmez. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> Şekil 3 a.) Sütun zenginleştirme sonrası enkaz kirletici Düşük seviyede. R1, lenfosit kapısı. B) sütununda zenginleştirme sonrası enkaz kirletici düzeylerini yüksek. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> Şekil 4. Prekürsör B-hücrelerinin kümelerine denatüre DNA Zenginleştirme. Prekürsör B-hücre alt grupları izole) sonicated DNA yüksek kalitede. Kütüphane yapımı DNA için 200-600 bp bir ortalama sonicated edilir. Lane 1: Promega 100 bp ladder (katalog # G2101); Lane 2: izole Toplam DNA CD19 gelen + / CD34 + hücreleri; Lane 3: CD19 izole Toplam DNA + </sup&gt; / CD34 - / CD45 düşük hücrelerin; Lane 4: CD19 + / CD34 izole 100 ng DNA - / CD45 med hücreleri; Lane 5: CD19 + / CD34 izole 100 ng DNA - / CD45 yüksek hücreler. DNA 9 dk (; 30 sn OFF 30 sn) toplam on High Diagenode Bioruptor kullanılarak sonike edildi. DNA sütun saflaştırılmış ve SYBR yeşil nükleik asit jel leke ile% 1 agaroz jel üzerinde görselleştirilebilir. B) MIRA ActivMotif MethylCollector Ultra kiti, SLC25A37 ile PCR (1-6) ve APC1 (7-12) kullandıktan sonra onaylamak için yapılır denatüre DNA zenginleştirme. 1 &amp; 7: sonicated genomik DNA (hayır MIRA); 2 ve 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA; 3 ve 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 düşük DNA; 4 &amp; 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med DNA; 5 &amp; 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 yüksek DNA; 6 ve 12: Su kontrolü. SLC25A37 daha yüksek amplifikasyon metil DNA zenginleştirme teyitprekürsör B-hücrelerinin alt gruplarında.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood at JoVE.com

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Burada göbek kordon kanı habercisi alt B-hücreleri izole etmek için bir protokol açıklar. Nükleik asitlerin yeterli bir miktarı ve kalitesi hücrelerinden çıkarılır ve DNA ya da RNA kullanılarak daha sonraki deneylerde kullanılabilir.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K Görüntüleme.  University of Missouri-Columbia. Burada göbek kordon kanı habercisi alt B-hücreleri izole etmek için bir protokol açıklar. Nükleik asitlerin yeterli bir miktarı ve kalitesi hücrelerinden çıkarılır ve DNA ya da RNA kullanılarak daha sonraki deneylerde kullanılabilir.

Video: Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...