Bu videoda, in vitro biyolojik model olarak sıçan beyin mitokondrisi kullanarak membran düzeyinde amiloid toksisite mekanizması için bir model çalışma açıklayınız. Fosfolipid model sistemlerinde amiloid agrega ile membran pertürbasyonlarının mekanizmasını açıklayan rapor birikimine rağmen, biyolojik membran geliştirmeye başlayan olayları doğrudan hedef alan çalışmalar. Bu videoda, alfa-sinüklein amiloid fibriller bir in vitro biyolojik model olarak sıçan beyin mitokondri membran analiz açıklar.
İyi karakterize membranlara sahip bir organel olarak mitokondrinin, nörodejeneratif hastalıklara bağlı membran düzeyinde amiloid sitotoksisite mekanizması ile ilgili moleküler çalışmalar için son derece yararlı bir biyolojik model sistemi sağlayabileceğine inanıyoruz. Küçük bir hayvan giyotin ile sıçan decapitate ve mitokondriyal özellikleriolası bozulmayı sınırlamak için sıçan ın decapitation bir dakika içinde ölçekten beyin kaldırmak. Bu hızlı bir şekilde çalışmak ve prosedür boyunca buz üzerinde her şeyi tutmak önemlidir.
30 mililitre izolasyon tamponu ile dokuyu iki kez yıkayın. Soğuk izolasyon tamponu içeren bir kabın aktarımı ve ince makas ile beyin kıyma. Doku süspansiyonu 20 mililitrelik soğuk bir homogenizer aktarın.
Motorlu bir pestisit ile dokuz yukarı ve aşağı vuruş kullanarak doku parçalarını homojenize. Homojenin soğuk kalmasını sağlamak için karışımı üç homojenizasyon vuruşundan sonra yaklaşık 30 saniye buzüzerinde bırakın. Homojeni önceden soğutulmuş bir santrifüj tüpüne ve santrifüje 1, 300 G'da dört santigrat derecede üç dakika aktarın.
Dikkatle supernatant decant ve önceden soğutulmuş santrifüj tüpü aktarın. Santrifüj 21, 000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika. Supernatant atın ve yavaşça pipet ile karışımı karıştırarak bir yoğunluk gradyan ortamda pelet resuspend.
Sabit açı rotorunda santrifüj 30, 700 G dört santigrat derecede beş dakika. Pasteur pipeti kullanarak, çoğunlukla miyelin içeren üstte biriken malzemenin keskin ucunu çıkarın. Mitokondriyal fraksiyona sekiz mililitre likit izolasyon tamponu eklerken, pipetle karışımı hafifçe karıştırın.
Santrifüj 16, 700 G dört santigrat derecede 10 dakika. Dikkatle supernatant çıkarın, alt gevşek pelet rahatsız bırakarak. Hafifçe pipet ucu ile karışımı karıştırArak tüp centrifuge tüp mililitre yağ asidi içermeyen BSA başına bir mililitre 10 miligram ekleyin.
İzolasyon arabelleği ekleyerek hacmi beş mililitreye kadar yapın. Santrifüj 6, 900 G dört santigrat derecede 10 dakika. Bu sağlam bir pelet üretmek gerekir.
Supernatant decant ve yavaşça izolasyon tampon içinde mitokondriyal pelet resuspend. Soğuk izolasyon tamponu ile mililitre başına bir miligrama kadar seyreltilmiş mitokondriyal homojenve iki 1,5 mililitrelik tüpler, genellikle tüp başına mitokondri mikrolitre yer. Maksimum enzim aktivitesi için pozitif kontrol olarak bir tüpe triton X-100 başına beş mikrolitre %20 hacim ve kontrol için başka bir tüpe beş mikrolitre deiyonize su ekleyin ve ardından bir karıştırıcı ile karıştırın.
Tüpleri 30 santigrat dereceye ayarlanmış ılık su banyosunda 10 dakika kuluçkaya yatırın. 16 sabit açı rotor tüplerin santrifüj tarafından Pelet mitokondri 15 dakika için 16, 000 G dört Santigrat. Bir sonraki bölümde açıklanan standart bir spektrofotometrik test kullanarak mitokondriyal malate dehidrogenaz aktivitesini değerlendirmek için elde edilen süpernatantları dikkatlice toplayın.
Mitokondriyal membranın bütünlüğünü aşağıdaki gibi hesaplayın. Malate dehidrogenaz aktivitesi tayini için, pipet 890 ve 880 mikrolitre 50 milimolar Tris-HCL tampon boş ve örnek test cuvettes sırasıyla 100 mikrolitre 50 milimolar okaloasetat ve 10 milimolar beta-NADH 10 mikrolitre izledi. Bir spektrofotometre ve referans boş karşı cuvettes koyun.
Örnek cuvette için mililitre başına 10 mikrolitre mitokondriyal homojen ekleyin. Hemen ters tarafından karıştırın. Bir dakika için 340 nanometre DE NADH oksidasyonu nedeniyle absorbans rekor azalma.
Alfa-sinüklein amiloid fibrilasyon için, protein çözeltisi 294 mikrolitre ekleyin, her 1.5 mililitre tüp 200 mikromolar. Sonra altı mikrolitre ThT çözeltisi bir milimolar ekleyin. Çözeltileri karıştırın ve tüpleri 37 Santigrat'ta bir termomikte 800 RPM'de sürekli karıştırarak kuluçkaya yatırın.
Sığır insülin amiloid fibrilasyon için, protein çözeltisi 637 mikrolitre, 1.5 mililitre tüp 250 mikromolar ekleyin. Sonra karıştırma takip 13 mikrolitre ThT çözeltisi bir milimolar ekleyin. Net bir alt 96-iyi plaka her kuyuya protein çözeltileri aliquots 200 mikrolitre ekleyin.
Plakayı kristal berraklığında sızdırmazlık bandı ile kapatın. Plakayı Cytation 5 floresan plaka okuyucusuna yükleyin. ThT floresanını 12 saat boyunca 30 dakikalık aralıklarla ölçün.
440 nanometrede uyarma ve 485 nanometrede emisyon kullanın. Kuyuları seçin. Her ölçümden önce plakayı beş saniye sallayın.
Sıcaklığı ajitasyon olmadan 57 santigrat dereceye ayarlayın. Mitokondriyal homojenler içeren 1,5 mililitrelik tüpler, MDH salınım tayı için bir seri ve mitokondriyal ROS ölçümü için diğer iki seri hazırlayın. Alfa-sinüklein taze veya amiloid fibrils aliquots ekleyin, sığır insülin veya tavuk yumurtası beyaz lysozyme mitokondriyal homojenate ve ardından yavaşça pipetleme.
30 Santigrat dereceye ayarlanmış ılık su banyosunda 30 dakika boyunca mitokondriyal süspansiyonlar içeren tüp. Malate dehidrogenaz salınım ıskalaması için santrifüj 16,000 G'de 15 dakika kuluçkaya yatırılan mitokondriyal homojendir. Protokol bölüm dört açıklanan mitokondriyal MDH etkinliğini atamak için elde edilen supernatants dikkatle toplamak.
MDH'nin serbest bırakılmasını aşağıdaki gibi hesaplayın. Mitokondriyal ROS ölçümü için, pipet 191 mikrolitre inkübir mitokondriyal 96 kuyulu bir plakanın her kuyusu için homojendir. 50 mikromolar DCFDA dört mikrolitre ekleyin.
Sonra 200 milimolar sinkin beş mikrolitre ekleyin. Hafifçe karıştırarak 30 Santigrat ayarlayın ılık su banyosunda 30 dakika boyunca plaka kuluçka. Plakayı Bir Cytation 5 floresan plaka okuyucusuna yükleyin ve protokol bölümüne göre floresan yoğunluğunu ölçün.
Triton X-100 ile membran bozulması ve enzim salınımından önce ve sonra izole mitokondride MDH aktivitesi ölçülerek mitokondriyal membran bütünlüğü değerlendirildi. Gördüğünüz gibi, mitokondriyal preparatların %93 civarında sağlam olduğunu gördük. ThT floresan tsay amiloid fibrils büyümesini izlemek için yapılmıştır.
Üç proteinin amiloid fibrilasyon eğrisi tipik bir sigmoidal desen gösterdi, alfa-synüklein için yaklaşık 96 ulaşan, 12, ve 96 alfa-synüklein için saat, sığır insülin, ve tavuk yumurtası beyaz lysozyme sırasıyla, AFM ölçümü ile doğrulandı amiloid fibrils oluşumunu düşündüren. Mitokondriyal membranın amiloid fibriller tarafından olası permeabilizasyonu ve hasarı mitokondriyal MDH ve mitokondriyal ROS ölçümü ile araştırıldı. Sol grafikte de gördüğünüz gibi, mitokondriye alfa-sinüklein amiloid fibrillerin eklenmesiyle MDH'nin önemli ölçüde salınımı gözlenmiştir.
İnsülin fibriller tarafından hafif bir salınım saptanırken, tavuk yumurtası beyaz lysozyme fibrils etkisiz bulundu. Sağ grafik, amiloid fibrillerin mitokondriyal ROS içeriği üzerindeki etkisini göstermektedir. Tavuk yumurtası beyaz lysozyme veya insülin amiloid fibrillerin eklenmesi yle mitokondriyal ROS'ta önemli bir gelişme gözlenmezken, alfa-sinüklein fibrilleri ile tedavi beyin mitokondrisinin ROS içeriğinde önemli bir artışa yol açtı.
Bu video, çeşitli proteinlerden kaynaklanan amiloid fibrillerin farklı derecelerde membran hasarına ve permeabilizasyona nasıl yol açabileceğini gösteren, membran düzeyinde fibula agrega sitotoksisite mekanizması için bir model çalışma açıklar. Amiloid fibriller ve spesifik bağlayıcı membran bazı konular ile etkileşim ve membranların bozulma ve sonraki tedirginliklere neden kapasitesi sağlamak için görünür iken. Bu videodan sonra, farklı dokulardan veya beynin çeşitli bölgelerinden izole edilmiş mitokondri ile doğal form, pre-fibrillar ve farklı peptidlerin olgun amiloid fibrils etkileşimini araştırmak mümkün olacak.
