This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. Hücre Ekimi ve transfeksiyonu <ol><li> Bir hücre kültür kaput, plakasının 300,000 ~ 500.000 SN56 hücreleri (Dr. Jane Rylett bir tür hediye) 35 mm cam alt konfokal çanak ve (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM ile takviye ön transfeksiyon ortamı ile kapak % 10 FBS). </li><li> Çoğalan bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe hücreleri. Not: Hücreler yaklaşık olarak% 50 transfeksiyondan önce -70% konfluent olmalıdır. </li><li> Bir hücre kültür davlumbaz, bir flüoresan proteini eksprese eden plazmidler ile transfekte hücreler bir floresan proteini burada bölmesi işaretleyici (ile etiketlenmiş lizozom bağlantılı membran proteini 1, LAMP1 etiketli TGN markör (GaIT-CFP Cyan Floresan Protein bağlanmış galaktosil transferaz) etiketli MRFP) ve paGFP (βAPP-paGFP ile etiketlenmiş ilgi protein). (Bu yapılar daha önce 30 tarif edilmiştir) </li><li> Transfeksiyon reaktifi ve plazmid DNA f hücreleri inkübeveya% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 24 saat. En iyi dengeyi sitotoksisite ve transfeksiyon verimi transfeksiyon ajanı 5 ul (örneğin, Lipofectamine 2000) DNA 2 ~ ug oranı kullanın. Güncel konsantrasyonları farklı plazmid için optimize edilmesi gerekebilir. Burada tarif edilen deneylerde, 1 ug βAPP-paGFP bölgesinin / konfokal çanak LAMP1-MRFP 0.3 ug / konfokal çanak ve GalT-CFP 0,2 ug / konfokal çanak kullanmayın. Not: kullanılan plazmid miktarı transfeksiyon verimliliğine bağlıdır. </li><li> Nöronal hücre hatları için: Aşama 1.4 sonra, hücre kültürü kaputu, ön-transfeksiyon ortamını çıkarın ve 1 mM 24 saat boyunca siklik AMP (dbcAMP) dibutiril% 0.1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş 2 ml DMEM içinde SN56 hücreleri ayırt. </li></ol> 2. Mikroskop Sahne Hazırlığı <ol><li> Ön sıcak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 37 ° C Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). IMAGI önce ısınma mikroskop aşaması37 ° C&#39;ye kadar değişmektedir. </li><li> Iki kez PBS ile yıkayın hücreleri, farklılaşma ortamını çıkarın ve 37 ° C &#39;de 2 ml HBSS ile değiştirmek için. Mikroskop aşamasında üzerine yerleştirin hücreleri 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. Not: Hücreler HBSS yaklaşık 1.5-2 saat yaşayabilir. </li><li> Konfokal plaka sıcaklığı mikroskop sahne ile dengelenmesi için 5-10 dakika bekleyin. </li></ol> Golgi üzerinde İB&#39;nin 3. Fotoğraf aktivasyon <ol><li> Mikroskop mercek ile GalT-CFP, LAMP1-MRFP ve βAPP-paGFP transfekte hücreleri bulabilirsiniz. <ol><li> Yüksek büyütme (yani 63X veya 100X) ile bir yağ daldırma objektifi kullanın. Floresan görsel yapısındaki için, ve rodamin (MRFP floresan) (OBP ve GFP floresan) FITC görselleştirme yeteneğine set bir filtre kullanın. </li></ol></li><li> 1 mikron Her kanal için konfokal dilim ayarlayın. Düşük çözünürlüklü görüntü almak. </li><li> Görüntüye Crop ilgi sadece hücre. </li><li> Ayar düğmesini kullanarak, manuel olarak ayarlanabilirHücrenin ortasında odak düzlemi. Bu, tipik olarak en büyük hücre çekirdeği bir parçasıdır. </li><li> TGN (GalT-OBP floresan) içinde (ROI) İlgi 3-5 dairesel Bölgeler çizin. <ol><li> (Yani Zeiss LSM programında) İB&#39;leri çizmek için, komut konsolunda &#39;Düzenle ROI&#39; düğmesini seçin. </li><li> Dairesel ROI düğmesini seçin. </li><li> Tıklayın ve GalT-OBP hücrenin pozitif bölgeleri üzerinde sürükleyin. Not: Birçok mikroskoplar fotoğraf beyazlatma paketleri, bu yeteneğe sahip. </li></ol></li><li> Kaplanmış ROI ile hücrenin bir görüntü alın. Daha sonra başvurmak üzere ROI bir kopyasını kaydedin. <ol><li> Görüntüye İB&#39;leri kaydetmek için, &#39;Makro&#39; düğmesini seçin. </li><li> &#39;CopyRoisToOverlay&#39; (c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb dosya yolu) başlatmak için &#39;Load&#39; düğmesine basın. Not: 475-525 nm (CFP) bant geçiren (BP), bir 500-530 nm BP (GFP) ile donatılmış bir konfokal mikroskopve 560 nm uzun geçiş (LP) filtre setleri gereklidir. 458 nm ve 488 nm emisyon ve 540 nm emisyon için HeNe lazer için bir argon lazer de gereklidir. </li></ol></li><li> Set-up bir ağartma süresi kurs için mikroskop. <ol><li> Maksimum güç lazer diyot (25 mW 405 nm lazer) ayarlayın. Dikkat: Aşırı fotoğraf aktivasyon hücresel membranlara fotoğraf toksisite veya hasar görmesine neden olabilir. Retina hasarı önlemek için koruyucu gözlük kullanın. </li><li> Set-up görüntüleme 120 döngüleri için mikroskop. Not: Bir görüntüleme döngüsü ROI içinde ağartma ve tüm hücre görüntüleme oluşur. Bu bir ağartıcı zaman derstir. </li><li> Her resmin sonra 20-30 yineleme sadece İB&#39;leri (foto-activate) ağartmak için mikroskop ayarlayın. Bir görüntü değişecektir imajı ve çamaşır suyu zamanı. Her döngü yaklaşık 30 sn yani görüntüler arasında bir zaman gecikmesi ayarlayın. Not: her döngünün görüntüleme bölümünün görüntü boyutuna bağlı olarak yaklaşık 15-30 sn sürer. Her RO için beyazlatmaBen yaklaşık 50 milisaniye olduğunu. 20 yineleme için tüm 4 İB&#39;nin Beyazlatma her ağartıcı / resim döngüsünün sonunda 4 sn alacaktır. </li></ol></li><li> Ağartma süresi kursu başlatın. </li><li> 15 dakika (görüntüleme ve beyazlatma 30 döngü) sonra beyazlatma kapatın, ancak hücre görüntüleri yakalamak devam edin. Not: min &#39;darbe&#39; dönemdir 0 15 zamanı. </li><li> ΒAPP-paGFP temizlenmesini takip etmek, (ağartma) olmadan 45 dakika için görüntü yakalamayı devam edin. Not: min &#39;kovalamak&#39; dönemi 15 45 zamanı. </li><li> Aşama 6&#39;da tarif edilen analiz yöntemi kullanılarak, her bir kanala yüzeyleri yaparak (burada LAMP1-MRFP) ilgi bölme ile ilgi (burada βAPP-paGFP) proteini ko-lokalize. </li></ol> 4. Alt Bölme belirleyin <ol><li> (Bu deneylerde) lizozom son bölmesi olup olmadığını belirlemek için, proteinler lizozom birikmesine neden zar geçirgen proteaz inhibitörleri ekleyin.<ol><li> ΒAPP için, 0.5 uM L685, 458 (spesifik γ-sekretaz inhibitörü), gece boyunca ya da görüntüleme önce 30 dakika süre ile 100 uM klorokuinin (deacidifies lizozomlar) kullanın. </li></ol></li><li> 3.8 - 3.1 adım olarak hücreleri ve photoactivate bulun. </li><li> ΒAPP-paGFP bölünme yokluğunda birikir burada görüntü (foto-aktivasyon) olmadan ek bir 45-dakika boyunca hücre belirlenmesi. </li><li> Aşama 6&#39;da tarif edilen yönteme göre, lizozomlar (veya diğer alt bölmeye) proteinin teslim ve daha sonra boşluk analiz edin. </li></ol> 5. Golgi içinde Photo-aktivasyon Doğruluğu sağlamak <ol><li> 37 ° C&#39;ye ısınma HBSS. </li><li> Her konfokal plaka HBSS 66 mcM nokodazolun (tedavi) veya DMSO (kontrol), görüntülü için, 2 ml solüsyon hazırlayın. <ol><li> Tek konfokal plaka, pipet 2 37 ° C HBSS ml ve 16.60 mM nokodazol stoktan nokodazolun içinde 7,96 ul ekleyin için. </li><li> Bir kontrol olarak, böylecedökülmesinden, pipet 2 bir 2 ml&#39;lik tüp içine 37 ° C HBSS ml DMSO 7.96 ul ekle. </li></ol></li><li> Görüntüleme önce 5 dakika boyunca nokodazolun veya DMSO içeren HBSS içinde hücreleri inkübe edin. </li><li> Adım 3.1 olarak hücreleri bulun. </li><li> Fotoaktivasyon önce, foto-aktivasyon süre sonra Z-yığını almaya mikroskop hazırlar. <ol><li> &#39;Z Stack&#39; butonuna tıklayın. Hızlı XY kullanarak taramaya başlayın. </li><li> Hücrenin üstüne mikroskop ayar düğmesi ile odak düzlemi ayarlayın. Basın &#39;Mark İlk&#39; yığının ilk pozisyonunu ayarlamak için. </li><li> Hücrenin altına mikroskop ayar düğmesinin (cam yakın) ile odak düzlemi ayarlayın. Basın &#39;Mark Son&#39; yığınında son konumunu ayarlamak için. </li><li> Z yığını panelinde, &#39;Z kesit&#39; düğmesine basın. 1 mikron &#39;Aralık&#39; ayarlayın. Daha yüksek uzaysal çözünürlüğü daha küçük bir yığın yığın aralığı için, ama daha fazla resim gerekecektir: Notyığının görüntüleme süresini uzatma alınacak. </li></ol></li><li> Aşama 3,7-3,8 de tarif edildiği gibi, hücreler, peroksijen ağartıcıdır. 15 dakika (30 kare) 0 dk Foto-activate ve görüntü. </li><li> 30 kare sonra görüntüleme durdurun. Hemen videonun bir görüntü kaydetmek. Dikkat: ikinci bir görüntüleme dizisi başlamadan önce kayıtlı değilse bazı mikroskoplar ilk video üzerine yazabilir. </li><li> Videoyu kaydettikten sonra, derhal adım 5.5 parametreleri kullanarak, Z-yığını kazanır. </li><li> Aşama 6&#39;da tarif edildiği gibi, GalT-CFP (ya da diğer Golgi işaretleyici) βAPP-paGFP Co-lokalize. OBP hızla ağartıcılar ve görüntüleme dönemi sonunda görünür olmayabilir: Not. Ko GalT-OBP mümkün olmayabilir. Ko gerekiyorsa, GALT etiketlemek için MRFP kullanın. </li></ol> 6. Vesikül Filtreleme ve ko <ol><li> Bölmenin yüzeyleri (örneğin LAMP1-MRFP) ve bir protein o yapmak için bir analiz programı (örneğin Imaris) kullanınf ilgi (örneğin βAPP-paGFP). </li><li> Üst menü çubuğunda Aşan butonuna tıklayarak analiz programı &#39;Aşmak&#39; bölümüne girin. </li><li> En soldaki panelden (soldan gelen 5. düğmesi) üstündeki yüzey sihirbazı düğmesini seçin. </li><li> Veziküller (yani βAPP-paGFP floresan, ilgi protein) filtrelemek için bir kanal seçin. </li><li> Bir sonraki sihirbazı ve basına alanında büyük vezikül çapını göndererek arka plan çıkarma gerçekleştirin. Analiz programı otomatik olarak seçer - ilgi kanalında bir alanda - alanındaki en büyük vezikül türetilen bir eşiğe göre. <ol><li> Elle gerekirse seçimi rafine eşik arka plan ayarlayın. </li></ol></li><li> Eşik seçim Ekranın alt kısmında, birleşik Yüzeyler ayırmak için &#39;Split dokunmadan nesnelerin seçeneğini işaretleyin. Not: Birçok veziküller yakından gruplandırılmış isegether, bir yüzey altında bu nesneler analiz programı olacak grubudur. <ol><li> 10-15 temsilci veziküller seçin ve ortalama vezikül çapı hesaplamak ve sihirbaz içine sonucu yazınız. </li></ol></li><li> Artan ya da &#39;Kalite&#39; (her yerde ortasında kanalın yoğunluğu) hakkında eşiği azaltarak seçilen tohum noktalarını daraltın. Not: ilgi kanalın yüzeyler oluşturulur. Seçilen yüzeylerin daha hassas hale bu noktada gerçekleştirilebilir. Her bir kesecik piksellerin sayısına göre eşik vesiküller dahil bulunmaktadır. </li><li> Bu yüzeye sahip orijinal kanal Maske. Maskelemek için, yüzey oluşturma sihirbazı (kalem) &#39;de, soldan 4 sekmesini seçin. </li><li> &#39;Tüm Maske&#39; seçeneğini seçin. Ilgi veziküller ile yeni bir kanal oluşturulur. Not: Maske işlemi sırasında, orijinal kanal çoğaltmak için bir seçenek sunuluyor. Orijinal veri kaydedilmesi gereken bu seçeneği belirleyin. </li><li> Tekrarlama sfiltre kanalı (örneğin, LAMP1 MRFP, bölme) için 6.7 ile Teps&#39;in 6,1. </li><li> Üst araç çubuğundan, ko aracını seçin. <ol><li> Üst panelde, kolokalize edilecek kanalların histogramlar göründükleri gibi, son zamanlarda oluşturulan maskeli kanalları seçmek. </li><li> Mevcut tüm verileri seçin. Bazen analizden sonra mevcut karanlık pikseller vardır. Histogramda bu pikselleri seçmeyin, onlar sonuçları çarpık olacaktır. </li><li> Sağında panelinde, &#39;Coloc Kanal Oluştur&#39; seçeneğini seçin. Bu yalnızca kolokalize pikselleri içeren yeni bir kanal oluşturur. Veri &#39;Kanal İstatistikleri düğmesinin altında aynı panelde olacaktır. Veriler CSV dosyası olarak ihraç edilebilir. </li><li> &#39;Malzeme Yüzde kolokalize&#39; istatistiğini kullanın. Bu seçenek, dikkate nesnenin piksel ve boyutu yoğunluğunu alır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Masters, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+plaque+core+protein+in+Alzheimer+disease+and+Down+syndrome.">Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).</li><li>Vassar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-secretase+cleavage+of+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+by+the+transmembrane+aspartic+protease+BACE.">Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE.</a> Science. 286 (5440), 735-741 (1999).</li><li>De Strooper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+presenilin-1+inhibits+the+normal+cleavage+of+amyloid+precursor+protein.">Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein.</a> Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+complexes+with+the+C-terminal+fragments+of+amyloid+precursor+protein+at+the+sites+of+amyloid+beta-protein+generation.">Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).</li><li>Li, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+is+linked+with+gamma-secretase+activity+in+the+detergent+solubilized+state.">Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).</li><li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+enhanced+amyloidogenicity+of+Alzheimer+A{beta}42+peptide+relative+to+A{beta}40.">Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40.</a> J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).</li><li>Pawar, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+'aggregation-prone'+and+"aggregation-susceptible.">Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible.</a> J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+haploinsufficiency+increases+Alzheimer's+disease+neuropathology.">VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology.</a> J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).</li><li>Rogaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+sortilin-related+receptor+SORL1+is+genetically+associated+with+Alzheimer+disease.">The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease.</a> Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).</li><li>Andersen, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sorting+protein-related+receptor+sorLA/LR11+regulates+processing+of+the+amyloid+precursor+protein.">Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).</li><li>Schmidt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SorLA/LR11+regulates+processing+of+amyloid+precursor+protein+via+interaction+with+adaptors+GGA+and+PACS-1.">SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1.</a> J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).</li><li>Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+anti-amyloid+immunotherapy+in+Alzheimer's+disease:+What+are+the+most+promising+targets.">Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets.</a> Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).</li><li>Pasternak, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1,+nicastrin,+amyloid+precursor+protein,+and+gamma-secretase+activity+are+co-localized+in+the+lysosomal+membrane.">Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane.</a> J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).</li><li>Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alkalizing+agents+on+the+processing+of+the+beta-amyloid+precursor+protein.">Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein.</a> Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).</li><li>Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+the+amyloid+protein+precursor+to+potentially+amyloidogenic+derivatives.">Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives.</a> Science. 255 (5045), 728-730 (1992).</li><li>Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+beta-amyloid+formation+identifies+proteolytic+precursors+and+subcellular+site+of+catabolism.">Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism.</a> Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+Fragments+of+Alzheimer+beta+-Amyloid+Precursor+Protein+Accumulate+in+Restricted+and+Unpredicted+Intracellular+Compartments+in+Presenilin+1-deficient+Cells.">Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells.</a> J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).</li><li>Perez, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+identifies+new+signals+for+beta-amyloid+precursor+protein+endocytosis,+turnover,+and+the+generation+of+secreted+fragments,+including+Abeta42.">Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42.</a> J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).</li><li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Is+Required+for+Synaptic+Activity-Dependent+Release+of+Amyloid-&#946;+In+Vivo.">Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-&#946; In Vivo.</a> Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).</li><li>Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dynamin-dependent+endocytosis+increases+shedding+of+the+amyloid+precursor+protein+ectodomain+and+reduces+generation+of+amyloid+beta+protein.">Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein.</a> BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).</li><li>Traub, L. M., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans-Golgi+network:+a+late+secretory+sorting+station.">The trans-Golgi network: a late secretory sorting station.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).</li><li>Vieira, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+the+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+from+the+endosome+to+the+TGN+is+S655+phosphorylation+state-dependent+and+retromer-mediated.">Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated.</a> Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).</li><li>Sullivan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+disruption+promotes+amyloidogenic+APP+processing.">Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing.</a> Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).</li><li>Fjorback, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+binds+the+FANSHY+sorting+motif+in+SorLA+to+regulate+amyloid+precursor+protein+sorting+and+processing.">Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing.</a> J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+GFP+for+Selective+Photolabeling+of+Proteins+and+Cells.">A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photolabeling+of+proteins+using+photoactivatable+GFP.">Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP.</a> Methods. 32 (4), 445-450 (2004).</li><li>Hirschberg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+secretory+protein+traffic+and+characterization+of+golgi+to+plasma+membrane+transport+intermediates+in+living+cells.">Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells.</a> J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını ya da çıkar çatışmalarının var.

Bu teknik daha sonraki ticareti ve bölünme görselleştirmek için TGN içinde paGFP ile etiketlenmiş membran proteinlerinin doğru fotoğraf aktivasyonunu açıklar. PaGFP 25 on yıl önce yaratılmış iken, bu aşağı bölmelere doğmakta proteinlerin kaçakçılığını takip etmek doğru fotoğraf aktivasyon ilk örneğidir. APP-paGFP kullanılarak önceki çalışmalar, fotoaktif Golgi 11 olduğu kabul edildi hücrenin bir peri-nükleer bölgesini oluşturur. Ancak, mikrograflar, lizozom...

Alzheimer hastalığı (AD), ayırt edici senil plakların ve beyinde nörofibriler yumakların (NFTler) varlığıdır. Yaşlılık plaklarının ana kurucu β-amiloid (Aβ) &#39;dir. Aβ kendi öncüsünden elde edilir; amiloid öncü proteini (APP) 1. APP Amiloidojenik bölünme β-sekretaz 2 ile APP ektoalan uzaklaştırılması ile başlar. Geri kalan 99 kalıntılı bir karboksil terminal parçası (CTF) Aβ 3-7 üretilmesi için γ-sekretaz ile bölünebilen. Birçok deneyler endozomal / lizozomal sistemine hücre yüzeyinden içselleştirilmesi sonra hücre yüzeyi APP bölünme belgelenmiş olmasına rağmen, son çalışmalar çok sayıda APP hücre içi ticareti, aynı zamanda işleme 8-11 düzenlenmesinde önemli olduğunu ileri sürmüşlerdir. Γ-sekretaz inhibitörleri ve Aβ Immun ile Aβ düzeylerini modüle girişimleri bir dizi olmuşturotherapies. Bununla birlikte, bu tedaviler ile son klinik çalışmalarda bazı durumlarda, zarar 12 neden olduğu, hiç bir yarar gösteren, vb. Aβ üretimini modüle etme bir atıl bir strateji APP alt-hücresel lokalizasyon ve γ-sekretaz etkileşimi değiştirmektir. Golgi plazma membranı ve endozomlar / lizozom Tüm APP γ-bölünmesi için mümkün olan yerel olarak önerilmiştir. Laboratuvarımızda yapılan araştırmalar APP ve γ-sekretaz lizozomal zarın 13 yerleşik proteinler olduğunu göstermektedir. Ayrıca, lızozomal γ-sekretaz bir asidik pH değerine uygun 13 sahip olduğunu bulduk. Buna ek olarak, klorokin ve NH4CI ile endozomal / lızozomal sisteminin alkalizasyon, Aβ 14 üretimini azalttığı gösterilmiştir. -y olan sekretaz engellenmesi veya nakavt veya Presenilin lizozom 15-17 APP-CTFS birikimine yol açar. Ayrıca, APP endositoz kesintiye Aβ üretimi 18-20 düşürmektedir. Doğmakta olan proteinler ve endozomal / lizozomal sisteminden geri dönüştürülmüş proteinler için bir sıralama istasyonu olarak Golgi önemine karşın, APP hücre içi ticareti detaylı 21&#39;de çalışılmamıştır. Son çalışmalar, APP retromer kompleksi ile etkileşim yoluyla trans-Golgi ağı (TGN) geri edilebilir olduğunu göstermiştir. Retromer kompleksinin Aşağı regülasyon Aβ üretimi 8,22-24 azalır. Ancak, Golgi dan APP&#39;nin çıkış iyi çalışılmamıştır. Örneğin transferrin reseptörü gibi hücre yüzey proteinleri, endositozu takip ederken, kolayca etiketli ve takip edilmesini, hücre içi proteinlerin kaçakçılığı, aşağıdaki daha zordur. Aslında, birkaç proteinler, hücre içi ticareti görüntülü vardı. Bu tür fotoğraf aktifleşebilen-GFP (paGFP) gibi floresan protein etiketleri, gelişi içi ticaretini incelemek için yeni araçlar sağladı. Foto-aktive olan GFP-GF şeklidirSentezden sonra neredeyse görünmez, ancak 413 nm lazer ışığı ile aktive edildikten sonra güçlü yeşil (GFP) floresan geliştirir ve bu sinyal gün 25,26 stabildir P. PaGFP kullanılarak yapılar Lizozomal Protein intralizozomal kaçakçılığı göstermek için kullanılmıştır zar proteini 1 (LAMP1) 25, Vesicular Stomatitis virüsü glikoproteini (VSVG, salgı yoluna bir belirteci) 27 hücre yüzey teslimat ve peroksizom ciro 28 ve 29 autophagosomes. Canlı hücrelerdeki TGN APP&#39;nin sıralama görselleştirmek amacıyla, C-terminali foto-aktifleştirilebilen (paGFP) bağlanmış APP&#39;nin son 112 amino asidini ifade plazmidi olarak tasarlanmış 30 (βAPP-paGFP olarak da adlandırılır). Ayrıca, tam uzunlukta APP bu deneyleri ve benzeri sonuçlar elde ettik; daha parlak görüntüler sağlar çünkü ΒAPP yapı burada kullanılmıştır. Daha sonra fotoğraf-activate &amp;# 946; sadece TGN APP-paGFP, TGN işaretleyici galaktosiltransferaz (GalT) tarafından sınırları çizilmiş olarak. APP perinükleer bölgeden hızla aksonal APP taşınmasını ve temizlenmesini görselleştirmek için paGFP ile etiketlendi olmasına rağmen, bu bir dikkatle tanımlanmış bölmeden başka 11,31,32 APP ticaretinin ilk göstergesidir. Burada, biz doğru TGN içinde foto-aktivasyonu ve aşağı bölmeleri ve lizozomlar 30 sonraki bölünme ve açıklık içine APP çıkışını göstermektedir. Golgi içinde doğru fotoğraf etkinleştirme diğer protein sistemleri yaygın olarak uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

Beta-amiloid (Aβ) Alzheimer hastalarının beyinlerinde bulunan senil plakların temel bileşenidir. Aβ p ve γ-sekretazlar Amiloid Prekürsör Protein (APP) sıralı bölünmesinden türetilmiştir. AD patolojiye Aβ önemine rağmen, bu bölünmeler hücre içi lokalizasyonu iyi kurulmuş değil. Laboratuvarımızda çalışmak ve diğerleri hücre yüzeyinden içselleştirilmesi sonra APP işleme endozomal / lizozom sistemini ima. Bununla birlikte, APP&#39;nin hücre içi nispeten örüntüsü oldukça olup. Hücre yüzey proteinleri birçok markalama tekniklerine düzeltilebilir olanı olsa da, Golgi zar proteinlerinin kaçakçılığı aşağıdaki için basit bir yöntem vardır. Bu amaçla, C-terminalinde foto-aktifleştirilebilen bir GFP (paGFP) etiketlenen APP yapıları oluşturulur. Sentezden sonra, paGFP düşük taban floresans sahiptir, ancak 413 nm ışık t uyarılabiliro güçlü, istikrarlı bir yeşil floresan üretir. Kullanarak Golgi markör galaktosil transferaz, bir hedef olarak Cyan Floresan Protein (GaIT-CFP) bağlanmış biz trans-Golgi ağı doğru olarak photoactivate APP edebiliyoruz. Bu floresan ile tanımlanan alt bölmelere trafiğini ilk endozoma (Rab5), geç endozom (Rab9) ve lizozom (LAMP1) için bölmesi markör proteinlerin etiketlenmiş olarak fotoaktif APP-paGFP daha sonra takip edilebilir. Bundan başka, klorokin ve γ-sekretaz inhibitörü L685, 458 de dahil olmak üzere APP işleme önleyiciler kullanılarak, tek hücreler içinde APP dönüşümünü incelemek için darbe kovalayıcı deneyler gerçekleştirmek mümkündür. Biz APP büyük bir kısmı hücre yüzeyinde görünen olmadan lizozoma hızla hareket eder ve daha sonra sekretaz benzeri çatlamalarla lizozoma temizlenir bulabilirsiniz. Bu teknik fro hücre içi proteinlerin kaçakçılığı ve işlenmesini takip için paGFP kullanımını gösteriraşağı bölmeleri golgi m.

Tipik sonuçlar βAPP (Şekil 1a b) TGN bırakarak hızla LAMP1 trafiğe görünür göstermektedir. Foto-aktivasyon süresi boyunca, veziküller lizozomlar (Şekil 1b) için tahsis golgi çıkış görülebilir. TGN foto-aktivasyon varken inhibitör tedavisi olmadan, paGFP floresan lizozomlarda görünür olacaktır. Foto-aktifleşmesini durdurduktan sonra, βAPP-paGFP hızla (1b Şekil 1a karşılaştırın) lizozoma silinir. Nokodazolun tedavisi bölmeleri etiketli G...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP at JoVE.com

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Hücre yüzey proteinlerinin nakil nispeten kolay çalışılan birlikte, hücre içi proteinlerin kaçakçılığı görselleştirme çok daha zordur. Burada, biz fotoaktıfleştırılebılır GFP içeren yapıları kullanmak ve doğru aşağı akım bölmelerine Golgi aygıtı gelen amiloid öncü proteinin izleyin ve açıklığını takip etmek bir yöntem ortaya koymaktadır.

Photoactivatable GFP ile APP Hücre içi Ticareti Görüntüleme

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

imaging-the-intracellular-trafficking-of-app-with-photoactivatable-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Görüntüleme.  Western University.  Hücre yüzey proteinlerinin nakil nispeten kolay çalışılan birlikte, hücre içi proteinlerin kaçakçılığı görselleştirme çok daha zordur. Burada, biz fotoaktıfleştırılebılır GFP içeren yapıları kullanmak ve doğru aşağı akım bölmelerine Golgi aygıtı gelen amiloid öncü proteinin izleyin ve açıklığını takip etmek bir yöntem ortaya koymaktadır. 

Video: Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Demir Oksit hESC ve hMSCs Etiketleme MR Görüntüleme in vivo Takip Non-Invasive Nanopartiküller

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Biyoloji

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

FDG micro-PET/CT ile Fare Brown Fat Fonksiyonel Görüntüleme

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Hızlı Sentezi ve GFP-tabanlı Muhabirleri ile Kimyasal Aktif Transkripsiyon Faktörleri Taraması

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.