Genom düzenleme teknolojisini ve lentivirus aracılı transgen dağıtım sistemlerini kullanarak, özellikle hematopoetik kök hücrelerde gen manipülasyonu olan fareleri kurmak için etkili ve ekonomik bir yöntem geliştirdik. Bu protokolün avantajı, geleneksel fare transgenik yaklaşımlarına kıyasla hematopoetik hücrelerde spesifik mutasyonları barındıran hayvan modellerini hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde oluşturabilmektir. Prosedürü gösteren Ying Wang, benim laboratuvarımdan bir araştırmacı olacak.
Lentivirüs parçacıkları oluşturmak için, kollajen çözeltisi ile altı iyi plaka kodlama ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat ve% 5 karbondioksit kuluçka ile başlar. Sonra, 293T hücreleri tabağa yerleştirin ve iki saat daha kuluçkaya yatırın. Bu arada, lentivirus vektör0.9 mikrogram, psPAX2 0.6 mikrogram ve pMD2 0.3 mikrogram birleştirerek üç transfeksiyon plazmidkarışımı hazırlamak.
G ve deiyonize 10 mikrolitre başına kuyu. Daha sonra, plazmid karışımına 50 mikrolitre 1X PBS ve seyreltilmiş PEI MAX beş mikrolitre ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra bir mililitre DMEM ekleyin.
Altı kuyu plaka medya aspire ve her kuyuya plazmid karışımı bir mililitre ekleyin. Tabağı üç saat daha kuluçkaya yatırın. Ortamı taze DMEM ile değiştirin ve 24 saat kuluçkaya yatırın.
Bir mililitre taze DMEM ekleyin ve 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Toplam 48 saatlik kuluçkadan sonra, süpernatant'ı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve serbest yüzen hücreleri çıkarmak için 3000 kez G'de 15 dakika santrifüj edin. Süpernatant'ı 0,45 mikrometre filtreden geçirin ve ultra santrifüjünü üç saat boyunca filtreleyin.
Dikkatle supernatant aspire, beyaz pelet geride bırakarak. 100 mikrolitre serumsuz hematopoetik hücre genişletme aracı ile peleti havalandırma olmadan yeniden askıya alın. Viral titreyi ölçmek için 10 mikrolitrelik bir aliquot tutun ve süspansiyonun geri kalanını kullanıma hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Kemikleri izole ettikten sonra, RPMI ile 50 mililitrelik konik tüp içine yerleştirin ve buz üzerinde tüp yerleştirin. Bir biyo-güvenlik kabininde, kemikleri steril 100 milimetrelik bir kültür yemeğine aktarın. Sonra künt forseps ile bir kemik kavramak ve dikkatle her iki epifiz kesmek için diseksiyon makas kullanın.
10 mililitrelik bir şırıngayı buz gibi RPMI ile doldurun ve kemik iliğini şafttan 100 milimetrelik yeni bir kültür yemeğine atmak için 22 kalibrelik bir iğne kullanın. Tüm kemik iliği toplandıktan sonra, 18 gauge iğne ile 10 mililitrelik bir şırınga ile kemik iliği geçirerek tek bir hücre süspansiyon yapmak. Hücre süspansiyonuna 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün.
Sonra el yazması yönlere göre tüp santrifüj ve supernatant aspire. Hücre peletlerini uygun bir birimde optimize edilmiş ayırma arabelleğinde yeniden askıya alın. Soy negatif hücreleri izole etmek için, üreticinin talimatlarına göre bir soy hücresi tükenme kiti kullanın.
Serumsuz hematopoetik hücre genişletme ortamında izole edilmiş soy negatif hücrelerini yeniden askıya alın. Hücreleri 37 derecede,%5 karbondioksitte iki saat boyunca kuluçkaya yatırın. Sonra el yazması yöngöre lentivirus ekleyin ve başka bir 16-20 saat için kuvöz hücreleri bırakın.
Ertesi gün, 15 mililitrelik konik tüp içinde lentivirus transduced hücreleri toplamak ve 10 dakika boyunca 300 kez G santrifüj. NHA yönergelerine göre, Reece Grubu düzey iki de lentivirus vektörleri işlemek için önemlidir. Tesis yönetmeliklerine göre önlemler alınmalıdır.
Supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve fare başına 200 mikrolitre RPMI'de peleti yeniden askıya alın. Fareleriçine nakli kadar oda sıcaklığında hücreleri tutun. İkinci ışınlama seansından sonra, retro-orbitally bir insülin şırınga kullanarak her anestezili fare içine transli delineage negatif hücreleri enjekte.
Kemik iliği naklinden 3-4 hafta sonra, kılcal tüpler kullanarak retro-orbital venden kan örnekleri alın. 20 mikrolitre kanın yuvarlak alt polistiren test tüplerine aktarın ve buza yerleştirin. RBC lysis sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca karanlıkta monoklonal antikorlar bir kokteyl ile hücreleri kuluçka.
Kuluçkadan sonra hücreleri yıkayın, onarın ve santrifüj edin ve 400 mikrolitre FACS tamponunda hücre peletini yeniden askıya alın. Akış sitometrisi tarafından analiz edilene kadar numuneleri dört derecede tutun. Soyu negatif hücre transdüksiyonunun başarısı RFP'nin akış sitometrik tespiti ile değerlendirilebilir.
Yedi günlük in vitro kültürden sonra ortalama hücrelerin %75.7'sinin transekçi olduğu gösterilmiştir. Akış sitometrisi de transduced ve non-transduced hematopoetik kök hücreleri ile reconstitution sonra fare periferik kan analiz etmek için kullanılmıştır. Nötrofillerin ortalama %94.8'i, monositlerin %93.5'i ve B hücrelerinin %82.7'si RFP'yi ifade eder.
RFP pozitif kan hücrelerinden elde edilen genomik DNA, dizi analizi için PCR güçlendirildi ve alt klonlandı. Çeşitli mutasyonlar saptanır ve klonların %69'u çerçeve veya erken dur mutasyonları gösterir. Bu işlemde başarılı olmak için yüksek antivirüs stoklarının hazırlanması ve hematopoetik hücrelerin transdüksiyon ve transplantasyonu için optimize edilmiş koşullar gereklidir.
Bu tekniği kardiyovasküler hastalıklarda hukuk çalışması için uyguladık. Ama aynı zamanda hematolojik malignite çalışma yararlıdır. Bu yöntem, hematopoetik sistemdeki yeni gen türlerinin fonksiyonlarını yüksek verimli ve yüksek bir şekilde incelememizi sağlar.
Bunu transgenik farelerin bulunabilirliği üzerinden topluyoruz.
